Елизавете в это время было 30 лет. Имея близкого фаворита графа Лестера, она не хотела и думать о замужестве, тем более что не имела желания разделять с кем-либо своей власти.
После замужества Марии отношение к ней Елизаветы очень охладело. Мария же Стюарт достигла вершины своей славы и власти. Она приблизила к себе графа Босуэла, врага своего родственника графа Меррея, принужденного теперь находиться в изгнании, но первое время ее царствования руководившего всей политикой Шотландии. Она выпустила из тюрьмы графа Гэнтли и приблизила его ко двору. Секретарем стал у нее молодой итальянец Давид Риччо. Вначале он был в качестве камер-лакея. Мария Стюарт очень любила музыку и окружала себя артистами, играющими на скрипке, на лютне, на флейте; у нее были также три певца, и к ним присоединялся иногда Риччо, чтобы петь басом, которого для хора недоставало. Найдя его в скором времени способным к более почетной службе, королева в 1564 году назначила его своим секретарем. Он так хорошо вел государственные дела, что королева очень скоро полюбила его. По его-то совету и устроился брак Дарнлея. Близость к королеве сделала его высокомерным и дерзким. Причиною изгнания Меррея был также и Риччо.
Дарнлей, живший некоторое время в согласии с Риччо, вскоре сделался его смертельным врагом. Человек честолюбивый и пустой, не отличавшийся ни кротостью, ни храбростью, ни умом, он очень скоро потерял любовь Марии Стюарт. Он ошибался в чувствах этого ветреного сердца. Он любил пить, проводить много времени на охоте, был груб и взыскателен. Он принуждал Марию Стюарт разделить с ним корону, то есть уступить ему половину верховной власти. Мария в пылу страсти обещала ему это. Но спустя несколько дней отказала в этом, быть может потому, что находила его неспособным или же потому, что уже не любила его. Не прошло и шести месяцев после замужества, как она уже утратила всякую привязанность к Дарнлею и даже старалась избегать его. Обманутый в своих честолюбивых замыслах, оскорбленный в своей привязанности, Дарнлей приписывал отчуждение от него королевы влиянию Риччо; он думал, что секретарь-итальянец был и советником ее, и любовником. «Я узнал, — говорил он, — что этот презренный Давид обесчестил мое брачное ложе». Поэтому Дарнлей решил отделаться от него. Свое горе он открыл двоюродному брату Джорджу Дугласу, который принял близко к сердцу воодушевлявшую его жажду мщения. Дарнлей послал Дугласа к лорду Рутвену, человеку смелому и гордому и желавшему возвышения своей фамилии, с просьбой принять участие в его мщении. Дело шло о том, чтобы убить Риччо и захватить силою корону. Хотя лорд Рутвен был в это время очень нездоров, однако же после непродолжительного колебания примкнул к заговору, в котором участвовали также лорд Линдсей и другие.
Заговор распространялся в глубокой тайне. Заговорщики вошли в тесное сношение с изгнанными из Шотландии лордами, а также и с Мерреем и пастором Ноксом. Собравшись на границе, они составили союз, который и подписали вместе с королем. В нем объявлялось, что королева совращена с пути злонамеренными людьми, в особенности итальянцем Риччо, поэтому король Дарнлей положил с помощью дворянства и других лиц овладеть этими врагами государства и в случае сопротивления уничтожить их. Дарнлей обязался своим королевским словом поддерживать и защищать своих соучастников даже в присутствии королевы и внутри дворца; графы же и лорды обещали поддерживать справедливые требования Дарнлея, быть друзьями его друзей и врагами его врагов, поднести ему корону, поддерживать протестантское исповедание и сражаться с его противниками. Копии с этого акта были посланы Сесилю, секретарю английской королевы. Елизавета, узнав о заговоре, и не подумала препятствовать ему. Между тем заговорщики собрались в столице Шотландии — Эдинбурге. Самые ревностные из них — пасторы Нокс и Крэг в своих проповедях призывали суд Божий на несправедливых временщиков и ссылались на Библию.