Повлиян от Райт, Флеминг бил скептично настроен, че някога би могло да бъде открито химическо вещество, което да лекува инфекции, като съмненията му се подсилвали от опита му в изследването на причините за инфектиране на рани през Първата световна война. Той и Райт били разположени в казино в Булон, което превърнали в бактериологична лаборатория, за да разберат по-добре как да спасяват животи. Там Флеминг показал с тестови тръбички, деформирани като разкъсани рани, че антисептици като карболовата киселина са противопоказни, понеже убиват белите кръвни телца на организма, без да достигат до причиняващите гангрена бактерии дълбоко в процепите на раната. Затова Флеминг и Райт заявили, че раните трябва да бъдат почиствани с физиологичен разтвор. Това било важно откритие, но занимаващите се с раните лекари го игнорирали почти напълно, тъй като им се струвало съвсем погрешно да не третират раните с антисептици.
Флеминг бил отдаден на идеите на Райт, но не ги следвал като догма. Преди войната той приел базираната на арсен химиотерапия на медицинския учен Паул Ерлих – лекарството салфарзан (известно още като арсфенамин) срещу сифилис, което спечелило на създателя си името „доктор Сифилис“. Флеминг знаел, че има и други начини за лечение на болести, освен стимулирането на фагоцитите. През 1921 г. той установил, че протеинът лизозим убива бактерии, при това го открил в собствените си секрети от носа, в сълзите, слюнката и други телесни течности. Лизозимът се отделял от фагоцитите и бил естественият антисептик на тялото. Това подсказвало за възможността да бъдат намерени вещества, които при инжектиране в тялото щели да убиват бактериите. Самият лизозим обаче се оказал безполезен срещу най-вирулентните видове болестотворни бактерии.
Така Флеминг бил поне отчасти подготвен за откриването на пеницилина или „сока от плесен“, както го нарекъл отначало. В поредица експерименти той показал, че пеницилинът убива много видове вирулентни бактерии по-ефективно от повечето антисептици, но не убива собствените защитни фагоцити на организма. Но първите опити с пеницилин като местен антисептик при инфектирани рани били разочароващи. Никой все още не разбирал, че той действа най-добре при инжектиране в тялото. Освен това било трудно да се произведе в големи количества или да се съхранява. През 1936 г. фармацевтичната компания „Скуиб“ заключила, че „с оглед на бавното разработване, липсата на стабилност и бавното антибактериално действие на пеницилина неговото производство и продажба като бактерицид не изглежда осъществимо“. Така пеницилинът изпаднал в миманса за повече от десет години като любопитно, но недоразвито лекарство. Флеминг бил в лабораторията, а не в клиниката или в борда на директорите.
Като цяло се приема, че избухването на войната ускорило разработването на антибиотиците, но доказателствата сочат, че това може би е погрешно. На 6 септември 1939 г., само дни след началото на Втората световна война, двама учени от Оксфорд кандидатствали за грант за изследването на пеницилина все още от научна, а не от практическа гледна точка. Работели по него от повече от година, а войната направила получаването на парите още по-трудно. Съветът по медицински изследвания и фондацията „Рокфелер“ отпуснали значително по-малко от исканото, като фондацията посочила като причина несигурността на военното време. Така че на този етап избухването на войната всъщност забавило разработването на пеницилина.
Двамата учени, Ернст Чейн, биохимик, избягал от Германия, и Хауърд Флори, австралийски патолог, се натъкнали на работата на Флеминг и решили да я разгледат по-подробно преди началото на войната. Въпреки военновременния недостиг на подходящи материали, пари и хора, през май 1940 г. техният колега Норман Хийтли извлякъл пеницилин и го инжектирал на мишки, за да покаже, че той не им вреди. На 25 май, събота, Флори инжектирал четири мишки с пеницилин, преди да ги зарази, и оставил други четири мишки като контролна група. После инжектирал и двете групи с огромна доза стафилококови бактерии. Същата нощ четирите мишки, които не получили пеницилин, умрели. Другите четири обаче оцелели.