Белок Bt активен не только против европейского мотылька кукурузы, но также против юго-западного мотылька и кукурузной моли. Ориентировочные потери от этих основных вредителей кукурузы составляют 800-900 млн долл. ежегодно.
Гербицидустойчивые растения
Современное сельскохозяйственное производство невозможно без применения гербицидов. Применяемые ранее гербициды, как селективные, так и тотального действия, считались сравнительно дорогими и оказывали отрицательное воздействие на окружающую среду, накапливаясь в почве, почвенных водах и произрастающих растениях. Синтезированы гербициды нового поколения, которые значительно более эффективны и поэтому применяются в очень низких концентрациях и быстро разрушаются почвенными микроорганизмами. Однако они являются неселективными и ингибируют рост как сорняков, так и всех культурных растений.
Устойчивость растений к гербицидам может возникать различными путями. Она может быть результатом точечных мутаций генов, кодирующих белок-мишень для данного гербицида. Такие мутации описаны по устойчивости к гербицидам, которые действуют на фотосинтез растений и синтез аминокислот. Эти мутации и являются причиной появления на полях устойчивых сорняков, что приводит к необходимости ротации гербицидов через определенное количество лет, когда устойчивые сорняки накапливаются в количествах, могущих снизить эффективность применения данного гербицида.
Придание растениям устойчивости к тем или иным гербицидам осуществляется разными способами, например путем введения генов, кодирующих белки, не чувствительных к данному классу гербицидов (например, к глифосату, хлоре ульфуроновым и имидазолиновым гербицидам) либо обеспечивающих ускоренный метаболизм гербицидов в растениях (например, глюфосината аммония, далапона).
Устойчивость к глюфосинату аммония. Действующее вещество гербицидов, полученных на основе глюфосината аммония, — фосфинотрицин, ингибирующий глутаминсинтетазу растительных клеток, что приводит к быстрому истощению запаса глутамина в растении, накоплению аммиака, отравлению и гибели растения. Ген устойчивости к глюфосинату кодирует синтез фермента фосфинотрицин ацетилтрансферазы. В результате растение, в которое введен этот ген, обладает способностью продуцировать фосфинотрицин ацетилтрансферазу, разрушающую глюфосинат аммония, и устойчиво к действию данного гербицида.
Устойчивость к глифосату. В настоящее время самый широко применяемый гербицид в мире — глифосат, что повлекло за собой создание ГМ растений, обладающих устойчивостью именно к нему. Он относится к неселективным гербицидам. Механизм его действия основан на ингибировании активности фермента, который катализирует ключевую реакцию в синтезе ароматических аминокислот. В трансгенное растение встроен ген, кодирующий синтез этого же фермента, но не чувствительного к действию глифосата. При его воздействии все растения, не имеющие данного гена, погибают, в то время как ГМ культура нормально развивается.
Устойчивость к гербицидам может быть связана также с амплификацией генов устойчивости. Отселектирована клеточная линия табака, устойчивая к сульфонилмочевинным и имидазолиноновым гербицидам. Фермент-мишень ацетогидоксикислая синтаза этой линии была в 50-780 раз менее чувствительна к гербицидам, чем фермент дикого типа. С помощью гибридизации по Саузерну установлено, что амплификация одного из генов, кодирующих мутантный фермент, достигала примерно 20 копий.
Определена природа устойчивости мутантного фермента, связанная с заменой пролина в 196 положении на серии.
Фермент ацетолактатсинтаза (ALS) является мишенью для ряда гербицидов: сульфонилмочевин, имидазолинонов и триазолпиримидинов. Проведено клонирование гена ALS, его мутагенез in vivo и in vitro и трансформация гербицидустойчивого гена в растения рапса с помощью агробактерии. Отбор по устойчивости к канамицину и непосредственно по устойчивости к хлорсульфурону привел к появлению гербицидустойчивых растений.
Проведены полевые испытания трансгенных линий табака по чувствительности к сульфонилмочевинным гербицидам. В отсутствии обработки гербицидами обе трансгенные линии уступали контролю по урожаю.
При трансфекции протопластов табака геномной ДНК мутанта арабидопсиса, устойчивого к хлорсульфурону, толерантные каллусные линии получены с частотой 4,7x10"*.
Глифосат является активным ингредиентом неселективного гербицида Раундап. Он ингибирует синтез ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан) у бактерий и растений, а аrоА ген кодирует фермент-мишень EPSP синтазу (З-энолпирувилшикимат-5-фосфат синтазу), на которую действует глифосат.
Доказательством подобной функции было клонирование аrоА гена Escherichia coli — при его введении в мультиколийные плазмиды наблюдалась 5-17 кратная суперпродукция EPSP синтазы и, как следствие, 8 кратное повышение устойчивости к глифосату. Из кишечной палочки клонирован ген, введение которого в табак привело к получению устойчивых к глифосату растений.
При получении трансгенных растений петунии (Petunia hybrida) с высоким уровнем экспрессии аrоА гена они были устойчивыми к глифосату. Линия сои с агробактериальным геном, слабо чувствительным к глифосату, была очень устойчива к гербициду в полевых условиях, перенося обработку до 1,68 кг/га глифосата без видимых повреждений.
Клонирован также ген фермента глифосатоксидоредуктазы, превращающий глифосат в нетоксичное соединение — аминометилфосфоновую кислоту.
Комбинация двух генов СР4 и GOX использовалась фирмой Монсанто в качестве селектируемых генов при трансформации кукурузы и некоторых двудольных. При микробомбардировке незрелых зародышей микрочастицами вольфрама, покрытыми ДНК плазмиды, несущей СР4 и GOX гены, получены трансгенные растения пшеницы, устойчивые к коммерческим концентрациям глифосата.
В настоящее время изучен ряд штаммов стрептомицетов, которые в качестве вторичного метаболита продуцируют антибиотик биалафос. Биалафос (фосфинотрицин) был впервые выделен в культуре бактерий Streptomyces viridochromogenes в 1972 г. Он представляет собой трипептид и состоит из фосфинотрицина и двух остатков аланина. Биалафос был выделен также из одного штамма Streptomyces hygroscopicus.
Гербицид биалафос (фосфинотрицин) ингибирует глютаминсинтетазу. Ваr ген кодирует фермент, который ацетилирует гербицид, превращая его в нетоксичное соединение. Трансгенные растений с bar-геном приобретают устойчивость к данному гербициду.
Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам, используют все шире. Добавление всего одного гена приводит к тому, что растения приобретают устойчивость к гербициду, и обрабатывать посевы становится неизмеримо легче. Нелишне подчеркнуть, что речь идет об «экологически щадящих» гербицидах. Современное сельское хозяйство нельзя себе представить без гербицидов, поэтому ставка должна делаться на те из них, которые быстро разлагаются микроорганизмами в почве. К примеру, разработанный компанией «Монсанто» популярный гербицид «Раундап» примерно через неделю после опрыскивания полностью разлагается микроорганизмами в почве. Важно и то, что при этом удается избежать излишней вспашки, сохраняя структуру почвы и защищая ее от эрозии.
В создании растений, устойчивых к гербицидам, сейчас используют два основных принципа, через которые обеспечивается реализация задачи.
Гиперэкспрессия — значительное повышение синтеза продукта, против которого направлено действие гербицида. В этом случае при использовании гербицида в дозах, летальных для других растений, в ГМ растениях будет ингибирована только часть данного продукта. Оставшегося количества будет достаточно для поддержки функций организма. Поэтому гербицид не окажет на растение летального действия. Примером реализации такого подхода явилась работа (Lermontova, Grimm, 2000) по созданию растений табака, устойчивых к ацифлуорифену. Данный гербицид ингибирует фермент протопорфириноген IX оксидазу (РРОХ), участвующий в синтезе хлорофилла. Авторами было идентифицировано у табака два гена: один — РРОХ-1, кодирующий хлоропластный фермент, и РРОХ-2, кодирующий митохондриальный фермент. После этого растения табака были модифицированы генно-инженерной конструкцией, содержащей ген РРОХ-1, что обеспечивало высокий уровень его синтеза в молодых листьях. В результате трансгенные растения имели повышенный уровень содержания данного фермента, который коррелировал с их повышенной устойчивостью к ацифлуорифену.