Около половины XVI столетия, почти одновременно с возникновением Запорожья, в низовьях р. Дона утвердилась другая военная община – Донское казачество. И здесь, как за порогами Днепра, казачество образовалось и пополнялось главным образом из беглецов, но в Запорожье шли малороссы, а на Донщину – великороссы. История не сохранила прямых и точных указаний о первых выходцах на Дон и о тех побуждениях, которыми они руководились при этом. Но последующее и самый строй казачьей жизни, однако, ясно характеризует причины и условия возникновения Донского казачества. Как и Днепр, Дон с прилегающими к нему местностями был богат рыбой, зверями и пустующими, никем постоянно не занятыми угодьями. Теплый климат, почти непочатые дары природы и свободная жизнь служили уже достаточной приманкой и для обыкновенного выходца-колонизатора, а тем более для беглеца, ушедшего из Московского государства от бояр, дьяков и экономического порабощения. И свободный поселенец, и беглец одинаково могли считать себя здесь обеспеченными природой при удовлетворении первейших нужд и потребностей. Удаление от пределов Московского государства, пустынный край и соседство кочевников служили теми общими условиями, которые требовали от донских поселенцев военной организации и сноровки. Донской казак сразу же был поставлен в необходимость быть не столько мирным промышленником, сколько предприимчивым воином. И действительно, на первых порах своего существования донцы более, чем когда-либо, жили войною, на счет военной добычи. Чрез Азов на Астрахань лежал торговый путь в Азию, на котором донцы, по обычаю тех времен, «живились добычею» у купцов. Это, естественно, привлекало в их среду буйную вольницу Южной России, увеличивая состав войска. Таким образом, и на Дону, как на низовьях Днепра, казаки образовали прежде всего строго военную общину.
Подобно Сечевой организации, устройство внутреннего быта и отношений у донских казаков отличалось оригинальным, чисто народным складом, в духе Древней Руси. Как и у запорожцев, самоуправление сложилось у донцов из войсковых сходов и выборной старшины. Войсковой сход или «круг», как называли его донцы, напоминал собой запорожскую раду и древне-славянское вече. В войсковом кругу каждый казак имел право голоса наравне со всеми другими, не исключая и старшины. Кругу принадлежала административная, законодательная и судебная власть; он назначал походы и поиски неприятеля; на нем производилось разверстание земельных и др. угодий; ему подлежали утверждения судебных приговоров и смертной казни; в войсковом кругу, наконец, выбирались казачьи начальники. Главным исполнителем решений войскового круга был войсковой атаман, избиравшийся казаками ежегодно; в помощники атаману давались два, также выборных, есаула; письменные дела лежали на войсковом писаре или «дьяке». Кроме войскового круга и атамана, в казачьих городках или станицах были свои станичные круги и атаманы. Лица, стоявшие во главе войскового управления и сложившие свои полномочия, образовали собою «войсковую старшину», звание, ставшее впоследствии жалованным и приравненное к чинам регулярной армии. На первых порах существования большинство донских казаков, подобно запорожцам, вело безбрачную жизнь, и только впоследствии, по мере развития и умножения войска, постепенно увеличивалось количество семейных казаков. Точно так же и первые основы казачьего самоуправления подверглись с течением времени значительным изменениям. Так, войсковые атаманы с 1738 года начали назначаться по Высочайшему повелению; Екатерина II в 1775 году заменила войсковой круг войсковой канцелярией, в 1798 году, при Императоре Павле, войсковые чины были сравнены с армейскими, наконец, положением 1835 года войску была придана та организация, которая сохранилась у казаков, с немногими изменениями, до 1870 года, когда было выработано новое положение.