Все же несмотря на слабую результативность сеймовой борьбы православные вновь и вновь прибегали к этому средству защиты своих прав. По крайней мере, этим способом они могли сделать достоянием гласности творимые католиками бесчинства. Так, особую известность приобрело выступление православного депутата Лаврентия Древинского на сейме 1620 В своей речи этот волынский шляхтич, в частности, отмечал: «Уже в больших городах церкви запечатаны, церковные имения расхищены, в мрях нет монахов, там теперь запирают скот. Дети мрут без крещения. Покойников вывозят из городов без погребения, как падаль. Мужья с женами живут без церковного благословения. Народ умирает без причащения. Во Львове неуниат не может приписаться к цеху. К больному нельзя открыто идти со Святыми Тайнами. В Вильне тело православного покойника нужно вывозить из города только в те ворота, в которые вывозят нечистоты…». Повсеместно иезуиты и базилиане науськивали на православных католическую молодежь — учеников своих коллегиумов и школ, которые устраивали беспорядки в православных храмах и погромы в русских кварталах городов Речи Посполитой.
К сожалению, несмотря на то, что в численном отношении православные многократно превосходили униатов, среди противников унии становилось все меньше людей влиятельных и знатных, способных оказать действенную помощь Православной Церкви. Старые магнаты-защитники Православия постепенно уходили из жизни. В 1608 угас тяжело переживший Брестское предательство князь Острожский, дети которого стали католиками. Их судьбу разделило большинство магнатских и шляхетских фамилий Западной Руси, отпрыски которых переходили чаще всего даже не в унию, а сразу в латинство, привлеченные карьерными соображениями и соблазнами западной культуры. Западно-русская аристократия стремительно полонизировалась и переходила в стан врагов своего народа.
В то же время на смену православной шляхте пришла новая сила, способная вступиться за Православие, — казачество. Свободные воины, большая часть которых происходила из числа беглых холопов, спасавшихся в южных степях от панского произвола, — эти люди с одной стороны постоянно составляли оппозицию польскому королевскому правительству, а с другой — были ему необходимы для защиты юго-восточных рубежей Речи Посполитой от набегов татар и турок. Использовали поляки казаков и во время военных действий в Московском государстве в период Смутного времени. Заинтересованность властей в казачьем войске давала казакам возможность легализовать свое положение и сделать его достаточно стабильным. К началу XVII в. часть казачества прямо перешла на службу к королю и составила т. н. «Реестровое казачество», возглавляемое гетманом. Упрочение положения казачества, твердо стоявшего в Православии, делало его надежной защитой для Православной Церкви. В начале XVII в. возглавляемые гетманом Конашевичем-Сагайдачным реестровые казаки активно вступались за права Православной Церкви, неизменно ставя перед правительством как одно из условий своей службы королю требование соблюдать права православных. Правда, правительство Речи Посполитой считались с позицией казаков лишь на тех восточных землях государства, где власть Польши была слаба, а казачество, напротив, представляло наиболее влиятельную силу. По сути именно братства и казачество становятся с начала XVII века теми главными институтами, благодаря которым Православие в Западной Руси смогло не только выжить, но и организовать сопротивление унии, возродить полноценную духовную жизнь.
В начале XVII в. православные братства по-прежнему играли исключительно важную роль в религиозной жизни Западной Руси. Они продолжали деятельность, начало которой было положено задолго до унии и которая фактически компенсировала собой бездействие коррумпированного епата. После 1596, когда в Православной Церкви Западной Руси осталось всего лишь два архиерея, этот опыт оказался еще более востребованным. По-прежнему главным стрежнем деятельности братств являлись издательское и школьное дело.
В период борьбы с унией возникает и ряд новых братств. В их числе — Киево-Богоявленское, особенно знаменитое своей школой. Православное братство в Киеве возникло скорее всего в 1590-е гг. Однако заметное влияние на церковную жизнь Западной Руси оно начинает оказывать лишь после того, как в 1615 был основан Братский Богоявленский мрь. Он был возведен на земельном участке на киевском Подоле, который подарила братчикам Елизавета (Галшка) Гулевич. Супруга Мозырского маршалка Стефана Лозки, Галшка в первом браке была замужем за Христофором Поцеем, сыном будущего униатского мта. В отличие от семьи Поцеев, в которой господствовали униатские настроения, Галшка оставалась верна Православию. По этой причине она серьезно рассорилась с родней первого мужа. Возможно, что передача собственного наследственного владения под православный мрь мыслилась Галшкой Гулевич как своего рода компенсация за урон, нанесенный православным киевлянам со стороны ее свекра — униатского мта Ипатия, захватившего в Киеве ряд храмов.
На пожертвованной земле братство основало (или возобновило) мрь, который был освящен во имя Богоявления Господня. При обители была создана школа, которой впоследствии будет суждено перерасти в знаменитую Могилянскую коллегию, и далее — в академию. Ктитором Братского Богоявленского мря стал гетман реестрового казачества Петр Конашевич-Сагайдачный, который украсил обитель великолепным Богоявленским собором (строительство храма было окончено около 1620, позднее он был перестроен на средства гетмана Мазепы; уничтожен по решению советских властей в 1935).
Обитель вскоре заняла весьма видное положение в Киевской митрополии. Подобно Львовскому и Виленскому братствам, Киево-Братский мрь получил от КПлского пха право ставропигии. Первым строителем Братского мря стал Исаия Копинский, который перед тем обустраивал Густынскую обитель. Исаия не только начал работы по возведению главных построек в новоучрежденном мре, но и дал ему правила для устроения духовной жизни.
Для организации школьного дела Киевское братство привлекло наиболее выдающихся деятелей православной культуры Западной Руси. Первым ректором братской школы стал Иван Матвеевич Борецкий. Православный шляхтич, уроженец села Бирча (или Борча) в Галиции, он ранее был дидаскалом (преподавателем) школы Львовского братства. Позднее Иван Борецкий принял священный сан, переехал в Киев, где снискал себе славу не только своей ученостью, но и высокими духовными качествами. В 1618 братия Михайловского Златоверхого мря избрала Борецкого своим игуменом, и он принял постриг с именем Иов (его супруга также стала монахиней).
В Киево-Братской школе господствовали ярко выраженные антикатолические настроения, что приводило к доминированию здесь греческой богословской школы и сознательному, хотя и не безусловному, отвержению латинской учености. Это в значительной степени гарантировало школу Борецкого от латино-католического влияния, но в связи с упадком учености и у греков создавало немалые проблемы. Позднее их возьмется решать св. мт Петр Могила, который изберет противоположный путь в деле духовного просвещения, сделав его основой именно латинскую ученость, из которой долгим и сложным путем будет высвобождаться древняя православная основа.
Среди богословов, объединившихся вокруг школы Борецкого, было немало видных деятелей духовного просвещения, создавших незаурядные труды. К их числу принадлежали Лаврентий Зизаний, предпринявший попытку создания первого русского катехизиса, и Кирилл Транквиллион-Ставровецкий, также пытавшийся в своих трудах «Учительное Евангелие» и «Зерцало Богословия» систематизировать знания из области православной догматики. Правда, работы Транквиллиона грешили немалыми изъянами и были осуждены в Киеве и Москве как не вполне православные, ибо автор не смог удержаться от опасных латинских заимствований. Кирилл Транквиллион-Ставровецкий крайне болезненно воспринял критику со стороны своих собратий и в конечном счете перешел в униатство.
К кругу Иова Борецкого также принадлежал печерский инок Памва Берында, который прославился составлением первого лексикона церковно-славянского языка. Берында также явился создателем типографии, положившей начало книгопечатанию в Киево-Печерской Лавре. Книжное дело бурно расцвело в этой обители при архмте Елисее Плетенецком и стало особенно масштабным со времени Петра Могилы. Елисей Плетенецкий прославился как выдающийся настоятель обители, который вслед за своим предшественником — архмтом Никифором Туром — не только блестяще отразил все попытки униатов захватить Лавру, но и возродил в ней глубоко духовную монашескую жизнь, собрав вокруг себя многих замечательных подвижников того времени.