При Алексее Михайловиче малорусская вольная колонизация приняла еще большие размеры. Малорусы массами переселялись в пределы Харьковской и восточной части Полтавской губернии, известные под именем Слободской Украины. Города последней вскоре заслонили только что оконченную Белгородскую черту, западная часть которой с г. Ахтыркой заходила на территорию нашей области, в остальных своих частях проходя по Центральной черноземной области недалеко от северной границы нынешней Харьковской губ. К трем центральным городам Слободской Украины – восстановленному Цареборисову (близ устья р. Оскола), Чугуеву и Вольному – вскоре присоединились еще: Валки, Алешин (село Лебединского у.) Ахтырка, Бобрик (село Сумского у.), Каменное (с. Пригородка на р. Пселе Лебединского у.), Недригайлов, Тор (Славянск) и, наконец, Харьков. Из этих городов некоторые обязаны своим возникновением правительству, большая же часть – вольной – малоросской или смешанной с великорусской колонизации, так как последняя уже проникла в Харьковскую губ. Много тяглых людей из Московского государства бежали от усиливавшегося налогового гнета сюда на привольные степные земли. Пробирались сюда и промышленники – «охочьи люди» – с целью попытать счастья на соляных озерах близ Славянска, получая от правительства «на откуп» разработку этих естественных богатств.
Слагаясь из указанных элементов, новое население заняло при Михаиле Федоровиче пределы нынешних Ахтырского, Лебединского, Змиевского, Гадячского, частью Харьковского, Волчанского, Старобельского и Купянского уездов. По этнографическому составу ныне преобладают здесь малоросы, составляя до 70 % населения, тогда как великорусы дают всего 30 %. Последние при этом главным образом сосредотачиваются в восточных частях Харьковской губ., а именно на территории Старобельского, Змиевского, Волчанского, Харьковского и Купянского уездов.
Кроме правительственной и вольной колонизаций большое значение в населении края имели монастыри. Большинство их было основано выходцами из Польши, бежавшими от религиозных преследований после унии. Особенною известностью пользовались монастыри: Святогорский (Изюмского у.), Троицкий, Змиевский, Николаевкий, Ахтырский и Курядский (близ Харькова). Из них наибольшее значение в деле колонизации имел Святогорский монастырь на Донце. Расположенный весьма удобно на крутых меловых горах, где еще с XV в. спасались отшельники, он служил прекрасной крепостью, так как был хорошо укреплен самой природой (скалами), да кроме того имел пушки и был окружен стеной. Монастырь владел обширными участками земель и деятельно их заселял.
С конца XVI века южно-русское православное духовенство, по мере распространения унии и усиления преследования «хлопской» веры, как называли поляки православие, начало вести переговоры с Москвой о присоединении той части нашей области (западных двух третей), которая не была еще подвластна Москве. Множество монахов переселилось в русские пределы и основало здесь монастыри. Московское правительство охотно давало им свое покровительство. Особенно много милостей расточалось монастырям Мгарскому (Дубенского у.), Густынскому и Ладинскому (Прилуцкого у.), сильно подготовлявшим почву для соединения с Москвой русских земель польской короны.
В 1648 г. поднялось громадное восстание казаков под предводительством одного из казацких старшин Богдана (Зиновия) Хмельницкого. В союзе с крымским ханом Хмельницкий одержал ряд побед над поляками и своими «универсалами» поднял всю Украину. После поражения под Зборовом польский король Ян Казимир вынужден был возвратить казакам их былые вольности и увеличить число реестровых казаков до 40 тысяч. Однако вслед за этим последовало поражение казаков под Берестечком и новое сокращение числа казаков до 20 тысяч по условиям Белоцерковского мира. Вместе с тем снова усилилась панская колонизация, сопровождавшаяся закрепощением народа. Последний бежал в Слободскую Украину, где вскоре появились города: Сумы, Лебедин, Белополье и др. Под влиянием неудач Хмельницкий обратился к московскому правительству с просьбой принять Малороссию под царскую руку. После долгих переговоров земский собор 1653 г. высказался за присоединение. На раде в Переяславле были прочитаны условия последнего, и народ был приведен к присяге.