В Ватикане уже видели реальную перспективу распространить на украинские земли влияние католической церкви, обещали польскому королю небесные награды за такое благое дело и всячески муссировали планы церковной унии. Почти сразу после Люблинской унии на Украине появляются иезуиты, которые открывают бесплатные школы (преимущественно для детей шляхты) и активно ведут свою пропаганду.
Украинская шляхта не могла не видеть, что многие православные священники и монахи действительно погрязли в лени и распутстве, чревоугодии и мракобесии. Полуграмотные и незнакомые с греческим, они были очень слабы в богословии и ничего не могли противопоставить утонченным трудам своих католических оппонентов. Украинские шляхтичи стали все чаще отдавать в иезуитские колледжи своих детей, не имея достойной православной альтернативы и не желая, чтобы те отставали в образовании по сравнению со своими польскими сверстниками. Казалось, и здесь все пойдет по пути постепенного ополячивания и окатоличивания.
Совершенно неожиданно для католической церкви и польской шляхты эффект на украинских землях вышел противоположный. Одним из лучших учеников иезуитских коллегиумов становится будущий лидер украинского освободительного движения Богдан Хмельницкий. В ответ на насмешки и упреки в богословской беспомощности в Украине появляется целая сеть православных братств, главными действующими лицами которых были украинская шляхта и зарождавшееся казачество. Православные братства, создававшиеся на деньги добровольных пожертвований, учреждали школы, открывали типографии, печатали книги. Первая типография была создана на Украине в 1573 году во Львове. Затем типографии появились в Остроге, в Киево-Печерской лавре и других местах. К середине XVII века в Украине их насчитывалось уже 20. Для сравнения: в Москве в это время имелась только одна, под жестким контролем патриарха.
На Волыни возникает прославленный православный кружок Константина Острожского, первоочередной задачей которого стало издание Острожской Библии на церковнославянском языке. Работа острожских ученых была, по сути, историко-филологическим исследованием богословского характера, направленным на исправление ошибок переписчиков. Они сравнивали тексты, переводили с греческого и комментировали восточнохристианскую патристику. В Остроге существовала и школа, в которой преподавали грамматику, арифметику, астрономию, геометрию, музыку, риторику и диалектику, дополненные основами поэтики и философии. Ученики параллельно изучали греческий, латынь и церковнославянский. Среди выпускников Острожской школы были будущие киевский митрополит Иов Борецкий и гетман Петр Сагайдачный.
Конец XVI века становится периодом настоящего украинского возрождения, временем появления блестящих полемических трудов и богословских трактатов. Огромное большинство украинской шляхты видело именно в православии возможность сохранения национальной идентичности и способ противостоять польско-католическому натиску. Традиция братств превращала церковь в Украине в тесную семью, в которой забывались сословные различия, сообща решались материальные и прочие проблемы. Существовала и традиция избрания высшего духовенства (вплоть до митрополита) с участием прихожан-мирян, что еще больше объединяло православные приходы.
Однако церковная уния 1596 года (известная как «Брестская»), достигнутая частично благодаря подкупу ряда православных иерархов, частично благодаря силовому давлению, поставила православную церковь на территории Речи Посполитой вне закона. Отбираются церкви, монастыри, изгоняются священники. Любое сопротивление карается силой. Именно в этих условиях становится ясно, что мирным путем отстоять свою идентичность будет невозможно. Начинается эпоха казацких войн, соединившаяся с украинским возрождением по сути и целям.