Те же жидкости, которые совершенно не выдерживают нагревания, стали обеспложивать процеживанием через мелкопористые фильтры, сделанные из угля, асбеста и каолина, инфузорной земли. Если пропустить жидкость, содержащую микробы, через такой фильтр, то даже самые мелкие бактерии прилипнут к порам фильтра и застрянут в них. Жидкость окажется обеспложенной. Только самые мельчайшие микробы — фильтрующиеся вирусы — пройдут через такой фильтр. Пройдут через фильтр также и жизнеспособные частицы бактериальной клетки, так называемые фильтрующиеся формы бактерий.
Таким образом, сейчас в распоряжении микробиолога имеется целый ряд способов получения обеспложенных стерильных питательных сред.
Как же вырастить в такой среде чистую культуру микроба, т. е. культуру, происходящую из одной единственной клетки интересующего нас вида? Как выделить нужную нам клеточку диаметром в несколько тысячных долей миллиметра из смеси миллиардов особей, населяющих разводку микробов в жидкой среде?
Было предложено разводить такую среду какой-нибудь простерилизованной жидкостью (водой, солевым раствором) до тех пор, пока в одной её капле не будет содержаться только одна клетка микроба. Такой каплей заражали стерильную питательную среду.
Но этот сложный и трудоёмкий метод не давал всё же абсолютной гарантии чистоты культуры: можно ли быть уверенным, что в капельке действительно находится только одна микробная клетка? Удостовериться в этом можно было только при помощи микроскопа. Выделение чистых культур из одной клетки производится под микроскопическим контролем: на поверхность тоненького стерильного стёклышка (так называемого покровного стекла) стерильным чертёжным пёрышком наносят ряд крошечных капелек из разведённой питательной жидкости, содержащей микробов. Покровное стекло с каплями накладывается на предметное стекло с углублением, края обмазываются вазелином, и получается невысыхающая влажная камера. Микробиолог тщательно просматривает под микроскопом содержимое капелек и отмечает те капли, где находится только по одной клетке. Затем микроскоп вместе с препаратом ставится в особый шкаф — термостат — прибор, сохраняющий постоянную температуру, в котором культивируются разводки микробов. При благоприятной температуре микробная клетка начинает делиться, и скоро в капельке разрастается целое скопление микробов — потомков одной клетки. При помощи простерилизованной над пламенем горелки платиновой иголочки или петельки, вставленной в петледержатель, такой капелькой можно заразить колбу или пробирку с питательной средой и получить в нужном количестве чистую культуру из одной клетки. В последние годы сконструированы особые приборы, так называемые микроманипуляторы, которые дают возможность под контролем микроскопа подхватить тончайшей стеклянной петелькой или пипеткой одну микробную клетку и перенести её в свежую питательную среду. Советский ученый проф. Б. В. Перфильев недавно разработал способ изготовления тончайших стеклянных капилляров. Его прибор, так называемый микроселектор, позволяет под контролем глаза выловить и затянуть в капилляр одну клеточку мельчайшей бактерии, затем автоматически стерильно отломить содержащий эту клетку кусочек капилляра и заразить им свежую питательную среду.
Но обычно в своей текущей работе микробиолог применяет более простой способ получения чистых культур — выделение их на плотных питательных средах. Оставьте в комнате на 10–15 минут тоненький ломтик картофеля и потом, предохранив его от высыхания, поместите на сутки в термостат. Вы увидите, что на поверхности ломтя появились мелкие округлые образования грязно-белого, жёлтого и красноватого цвета. Это так называемые колонии микробов, осевших из воздуха на поверхность картофеля и размножившихся там до видимых невооружённым глазом скоплений (колоний). Каждая колония — это миллиардное потомство одной особи, приставшей к влажной поверхности картофеля. Р. Кох первый обратил внимание на то, что таким путём можно легко выделить чистую культуру микроба, и предложил свой метод «пластинчатых разводок», в которых развивались отдельные колонии, происходящие из одиночных клеток. Кроме ломтей картофеля и моркови, Кох предложил применять в качестве плотной питательной среды питательный мясной бульон, к которому прибавлено 10 процентов желатины. Получается плотный студень, на котором прекрасно развиваются отдельные колонии (рис. 21). Но так как желатина разжижается при 22–26° и не может выдержать температуры термостата, при которой обычно выращивают болезнетворных микробов, то она была заменена агар-агаром, который также придает плотность питательной среде, но плавится только при 100°, а застывает при 40–45°.