Рис. 21. Колонии различных бактерий на плотной питательной среде
Кох разливал свои желатиновые питательные среды на стеклянных пластинках, которые покрывал затем стеклянными крышками. Но этот способ оказался непрактичным. Пластинки Коха легко зарастали посторонними микробами, попадавшими из воздуха. В 1885 г. уже упомянутый нами доктор Гейденрейх, которому русская микробиология обязана тщательной разработкой и усовершенствованием методов исследования микробов, предложил вместо коховских пластинок специальные двойные стеклянные чашечки с крышками, хорошо предохранявшие культуры от загрязнения. Позднее такие же чашечки были описаны в германском микробиологическом журнале зарубежным микробиологом Петри и незаслуженно получили в литературе его имя.
Теперь методика выделения чистых культур стала довольно несложным делом (рис. 22). Разливают в чашки Гейденрейха-Петри расплавленную агаровую питательную среду, которая уже через несколько минут превращается в плотную пластинку. Потом размазывают по поверхности пластинки при помощи простерилизованной платиновой петли или стеклянного шпателя материал, содержащий микробные клетки, и ставят чашку в термостат. Через сутки на поверхности агаровой пластинки вырастают отдельные колонии микробов. Из этих-то колоний с помощью стерильной петли и производится отсев чистых культур в колбы или пробирки (рис. 23), содержащие стерильную питательную среду.
Рис. 22. Выделение чистой культуры микробов:
А — разливка агара в чашки Гейденрейха-Петри; Б — посев смеси микробов в чашку; В — отсев колоний с чашек при помощи платиновой петли; Г — пересев в пробирку на поверхность скошенного агара
Рис. 23. Бактериальный рост на поверхности скошенного агара
После введения методов чистых культур в практику лабораторных исследований микробиология стала развиваться бурным темпом. Кроме питательных сред, приготовленных из мяса, картофеля, хлеба, солода, стали применять свёрнутый яичный белок, кровяную сыворотку, цельную кровь. На этих средах прекрасно росли многие болезнетворные и гнилостные микробы.
Однако вскоре оказалось, что применявшиеся среды пригодны для выращивания далеко не всех микробов. На них хорошо росли только микробы, привыкшие и в природных условиях усваивать сложные органические соединения. Когда учёные попытались исследовать различные биохимические процессы, происходившие в почве, и выделить чистые культуры почвенных микробов, то выяснилось, что на обычных средах вырастают только гнилостные микробы. Ни за что не удавалось выделить в чистой культуре и уже известных в то время микробов, так называемых нитрификаторов, окисляющих конечный продукт гниения белков — аммиак в соли азотной кислоты. А не располагая чистыми культурами микробов, учёные не могли разобраться в физиологии этих организмов. Не удавалось выделить и другую чрезвычайно важную группу почвенных микробов — азотфиксирующих бактерий.
Открытием методов культивирования этих микробов мы обязаны «отцу почвенной микробиологии», знаменитому русскому микробиологу С. Н. Виноградскому. Микробы-нитрификаторы не растут на плотных мясных средах потому, что они не могут использовать сложные органические соединения — решил Виноградский. Чтобы их вырастить, нужно приготовить раствор из простейших минеральных солей, содержащих аммиак в качестве единственного источника азота. В такой жидкости не будут расти обычные гнилостные микробы, неспособные довольствоваться столь простыми соединениями. Опыты блестяще подтвердили предположение Виноградского: процесс нитрификации исправно шёл в этой простейшей питательной среде. Но как выделить чистую культуру этих бактерий, не растущих на плотной питательной среде? И тут Виноградский применил следующий чрезвычайно оригинальный метод: он делал высевы не из выросших колоний, а из пустых мест чашки с плотной питательной средой, на которой была засеяна смесь, содержавшая нитрифицирующие бактерии. Он совершенно правильно предположил, что там оставались неразвившиеся нитрифицирующие бактерии. Прикасаясь к пустым местам платиновой петлёй и перенося материал в минеральный раствор, он постепенно получил в этой накопительной среде чистую культуру нитрифицирующих бактерий.