С первого дня пребывания в Средиземном море русский флот, которым командовал граф Орлов, настойчиво искал встречи с турками. 23 июня в пять часов вечера на «Ростиславе» появился сигнал: «Вижу неприятельские корабли». Турецкий флот стоял на якоре между островом Хиос и Анатолийским берегом. В его составе находились шестнадцать линейных кораблей, шесть фрегатов и до 60 галер, шебек и галиотов. Командовал флотом Джейзайрмо-Хассан-Бей. Капудан-паша Хассан-Эддин находился на берегу. «Увидя такое сооружение, — доносил императрице граф Орлов, — я ужаснулся и был в неведении: что мне предпринять должно?» После совета флагманов решили атаковать неприятеля утром 24 июня.
В составе объединенных эскадр графа Орлова было девять линейных кораблей: авангард — «Евстафий», «Европа» и «Три Святителя»; кордебаталия — «Три Иерарха», «Януарий» и «Ростислав»; арьергард — «Не тронь меня», «Святослав» и «Саратов». Авангардом командовал Спиридов, кордебаталией — Орлов, а арьергардом — Эльфинстон. Фрегаты «Надежда благополучия», «Африка» и «Святой Николай», бомбардирский корабль «Ером», пакетбот «Почтальон» и транспорты «Орлов» и «Панин», а также несколько греческих судов держались в стороне. Решили атаковать неприятеля, сближаясь с ним в традиционной линии баталии.
В одиннадцать часов утра начали сближение. Первым шла «Европа», за ней «Евстафий» под флагом Спиридова. Как только корабли сошлись на пушечный выстрел, с турецких судов открыли ураганный огонь. Однако велся он беспорядочно и никакого вреда русским кораблям не причинял. Только сблизившись на пистолетный выстрел, Спиридов поднял сигнал: «Начать бой с неприятелем!». На всех русских кораблях, кроме стеньговых, были подняты Иерусалимские флаги: этим Орлов хотел подчеркнуть, что русский флот защищает христианство от ислама.
При сближении «Европы» с неприятелем командир корабля капитан 1 ранга Федот Клокачев из-за настойчивых требований греческого лоцмана (во избежание посадки на мель) вынужден был сделать поворот и выйти из строя. Спиридов же подумал, что «Европа» вышла из строя, не выдержав турецкого огня. «Поздравляю вас матросом!» — прокричал вдогонку Клокачеву Спиридов.
Впоследствии за Чесменское сражение Федот Алексеевич Клокачев получил орден Святого Георгия 4-й степени. В 1776 году он был произведен в контр-адмиралы и назначен командующим Азовской военной флотилией и портами, а в 1783 году в чине вице-адмирала стал первым командующим Черноморским флотом.
Сам же Спиридов с необычайным хладнокровием ходил по шканцам и отдавал распоряжения. На груди у него висел образ Святого Иоанна Воина, подаренный императрицей в Кронштадте. На юте «Евстафия» играла музыка.
После полудня «Евстафий» борт о борт сошелся с турецким кораблем «Реал-Мустафа». Бушприт «Евстафия» воткнулся в «Реал-Мустафу» между грот- и бизань-мачтами. Абордажные команды бросились на турецкий корабль. Завязалась ожесточенная схватка. Один из матросов вцепился в турецкий флаг, неприятельской саблей отрубило смельчаку руку, он протянул левую руку, но и она была ранена, тогда он вцепился в конец флага зубами. Но тут же был проколот насквозь. Не выдержав атаки, Хассан-Бей бросился за борт. За ним последовала вся команда. Тем временем пламя с горящего «Реал-Мустафы» перебросилось на «Евстафий». Маловетрие и избитый такелаж не позволили отойти. К «Евстафию» устремились шлюпки. Но успели снять только Г.А. Спиридова, Ф.Е Орлова и еще нескольких человек. На одной из шлюпок командир корабля А.И. Круз отправил с донесением к графу Орлову сына Спиридова. В донесении он поспешил сообщить о захвате неприятельского корабля «Реал-Мустафа». Когда сын Спиридова прибыл на корабль к Орлову, «Евстафия» уже не было; остались лишь плавающие обломки. Опечаленный Орлов утешился тем, что его брат Федор Орлов и адмирал еще до взрыва оставили корабль и перешли на пакетбот «Почтальон».
Командир «Евстафия» предпринимал отчаянные попытки спасти корабль. Отбуксировать корабль с помощью шлюпок не было никакой возможности.
Слишком прочно его удерживали снасти турецкого флагмана. Командир приказал залить крюйт-камеру, но и это не помогло. Горящая грот-мачта турецкого корабля упала поперек «Евстафия», и пожар стал общим, охватив и русский, и турецкий корабли. Прошло еще несколько минут, раздался оглушительный взрыв. Вначале взлетел на воздух «Евстафий», а за ним и «Реал-Мустафа». На «Евстафии» погибло 620 человек, в том числе 22 офицера, спаслись лишь командир капитан 1 ранга А.И. Круз, 9 офицеров и 51 матрос.
Шедший за «Евстафием» «Три Святителя», получив повреждения в парусах и такелаже, врезался в строй турецких кораблей. С обоих бортов этого корабля сделали 684 выстрела из пушек. Корабли кордебаталии сумели сойтись на пистолетный выстрел, а вот арьергард отстал и по существу в сражении не участвовал.
Не выдержав огня, турки начали сниматься с якорей и уходить в близлежащую Чесменскую бухту. Русский флот преследовал турок до самого входа в бухту, затем стал на якорь. Так завершилось Хиосское сражение.
О нем граф А.Г. Орлов доносил следующее: «В 10 часов сделан был сигнал к атаке, в полдвенадцати передовые корабли начали сражение, в половине перваго оно сделалось общим. Как ни превосходны были силы неприятельския, как храбро оныя ни защищались, но не могли вытерпеть жаркаго нападения войск В.И.В.; по продолжавшемся чрез два часа жесточайшем пушечном и ружейном огне, наконец, принужден был неприятель, отрубя якори, бежать в великом смятении в порт под крепость, называемую Чесме. Все корабли с великою храбростию атаковали неприятеля, все с великим тщанием исполняли свою должность, но корабль адмиральский „Св. Евстафия“ превзошел все прочие. Англичане, французы, венециане и мальтийцы, живые свидетели всем действиям, признались, что они никогда не представляли себе, чтоб можно было атаковать неприятеля с таким терпением и неустрашимостию. 84-пушечный неприятельский корабль был уже взят кораблем адмиральским, но по несчастию загорелся оный и сжег корабль и „Св. Евстафия“. Кроме адмирала, капитана и человек 40 или 50 разных чинов, никого с оного не спаслося, оба подорваны были в воздух. Как ни чувствительна была для нас потеря линейнаго корабля, но, увидя неприятельское поражение, робость их и безпорядок, в котором они находилися, утешилися, получа надежду истребить оный совершенно».
Обе стороны потеряли по одному кораблю. В Чесменской бухте оказались заблокированными пятнадцать линейных кораблей, шесть фрегатов, шесть шебек, восемь галер и 32 галиота. Вечером на бомбардирском корабле «Гром» контр-адмирал Грейг провел разведку боем, во время которой установил диспозицию турецкого флота. Орлов на «Трех Иерархах» созвал совет флагманов, вынесших решение — атаковать неприятеля в ночь на 26 июня. Трудно установить, кто подал мысль использовать брандеры, которых, однако, у русских не было. В качестве брандеров предложили использовать четыре самых крупных греческих судна: они были получены от греческих священников с острова Хиос — братьев Дмитрия, Афанасия и Степана Гунаропуло. Впоследствии, спасаясь от преследования, братья бежали в Россию, где были приняты императрицей и щедро вознаграждены за помощь при Чесме. Их потомки (среди них были и флотские офицеры) проживали в Петербурге, Николаеве и Херсоне.
В приказе Орлова говорилось: «Всем видимо расположение Турецкаго флота, который… стоит в бухте от нас на SO в тесном и безпорядочном состоянии; что некоторые носами к нам, к NW, а четыре корабля носами к NO, а к нам боками, несколько из них в тесноте стоит за своими к берегу так, как в куче… Наше же дело должно быть решительное, чтобы оный флот победить и разорить, не продолжая времени, без чего здесь в Архипелаге не можем мы к дальнейшим победам иметь свободный руки». В приказе также предписывалось подходить к неприятелю на такое расстояние, чтобы «не только нижняго дека, но и верхния пушки были бы действительны». Брандеры же в самом начале сражения должны были держаться подальше от неприятеля, «чтобы они до настоящаго дела были бы от неприятеля безвредны; дело оных состоит в том, чтобы они, пришед на неприятельский флот, зажгли его». В плане предусматривалась внезапная ночная атака специально сформированного отряда, которым командовал контр-адмирал Самуил Карлович Грейг.