Одновременно совершенствовались методы экспонирования самых разнообразных по характеру материалов. В 1928 году был издан новый путеводитель по музею, «так как за протекшие годы открыты новые отделы в результате проведенных исследований, а ранее существовавшие значительно пополнены новыми экспонатами и частично реорганизованы», - говорилось в предисловии к нему. Принципы научного комплектования и экспонирования коллекций рассматривались в музее на совещаниях, в лекциях и статьях, в докладах сотрудников музея на Первом Всероссийском музейном съезде в декабре 1930 года.
С начала 1930-х годов профиль музея, несмотря на наличие очень значительных художественных фондов, стал меняться в сторону краеведения. В это время музей назывался Государственным опытно-показательным краеведческим музеем в городе Истре (в период с 1920 по 1936 год название музея менялось несколько раз).
В конце 1935 года Наркомпрос РСФСР вынес решение превратить музей в Истре в опытно-показательный краеведческий музей Московской области. Вслед за тем в Москве был упразднен Московский областной краеведческий музей, выполнявший роль методического центра по руководству краеведческими музеями Московской области, а его функции были переданы музею в Истре. Туда же перевезли небольшие фонды упраздненного музея, главным образом этнографического характера. Так музей в Истре получил статус Московского областного краеведческого музея.
После изменения профиля перед музеем была поставлена задача в очень сжатые сроки создать экспозицию, отражающую историю, культуру и социалистическое строительство Московской области. Эта работа была заторможена сменой руководства музея (в 1937 году был репрессирован директор музея И. А. Шнеерсон).
Новая экспозиция была создана в Трапезных палатах к 1941 году. В ротонде Воскресенского собора экспонировалась' выставка атеистического характера.
С первых дней Великой Отечественной войны часть сотрудников музея ушла на фронт, остальные переключились на агитационно-массовую работу среди населения, участвовали в сооружении оборонительных укреплений. В июле 1941 года в музей поступило распоряжение подготовить экспонаты к эвакуации, но полностью оно выполнено не было. Только в октябре 1941 года, когда линия фронта была в 18 километрах от Истры, началась эвакуация музейного фонда. К этому времени была подготовлена к отправке только его часть: предметы из бывшей монастырской ризницы и некоторые художественные коллекции. Огромпая краеведческая экспозиция и выставка в соборе даже не были демонтированы. 7 ноября упакованные материалы были отправлены в Алма-Ату. Часть фонда была спрятана в соборе и башнях крепостной ограды.
Истра была оккупирована немецко-фашистскими захватчиками с 27 ноября по 11 декабря 1941 года. При отступлении саперы дивизии СС «Райх» взорвали Воскресенский собор, башни ограды, разрушили перекрытия Трапезных палат. При взрывах и пожарах погибла вся экспозиция довоенного музея. Территория монастыря была минирована, что затрудняло спасение уцелевших экспонатов после отступления фашистов. Общая стоимость ущерба, нанесенного музею войной, была оценена экспертной комиссией в 47,5 млн. рублей золотом. Данные о варварском разрушении Нового Иерусалима фигурировали в обвинительном заключении Нюрнбергского процесса.
С 1943 года Московский областной краеведческий музей временно находился в Москве, так как город Истра и Новоиерусалимский монастырь лежали в руинах. В 1944 году вернулись из эвакуации спасенные фонды музея, ставшие основой его возрождения в послевоенное время.
С конца 1940-х годов начались восстановительные работы на памятниках Новоиерусалимского ансамбля. Это дало возможность музею в конце 1950-х годов вернуться из Москвы в Истру.
В послевоенный период усилия научного коллектива музея были направлены прежде всего на изучение памятников восстанавливаемого ансамбля. Одновременно приводились в порядок сохранившиеся фонды музея: налаживались учет и хранение, велись изучение и реставрация коллекций. Большую роль в организации работы музея на этом этапе сыграл директор музея Д. В. Петков. Под его руководством была создана первая за послевоенный период экспозиция, посвященная истории и архитектуре Нового Иерусалима. Гибель во время войны историко-краеведческих фондов не позволяла создать краеведческую экспозицию, эта проблема в музее сохраняется и поныне.