С началом Великой Отечественной войны противотанковые возможности советских войск подверглись жестоким испытаниям. Во-первых, чаще всего стрелковым дивизиям приходилось вести бой, занимая превышающий уставные нормативы фронт обороны. Во-вторых, советским войскам пришлось столкнуться с немецкой тактикой «танкового клина». Она заключалась в том, что танковый полк танковой дивизии Вермахта наносил удар на очень узком участке обороны. При этом плотность атакующих танков составляла 50–60 машин на километр фронта. Такое количество танков на узком фронте неизбежно насыщало противотанковую оборону. Значительно облегчалась задача насыщения советской ПТО ее линейностью, т. е. равномерным расположением орудий по фронту обороны. Свою роль также сыграли технические сложности: ряд партий 45-мм бронебойных снарядов был перекален. Термообработанные с нарушением технологии снаряды не пробивали немецкие танки даже на тех дистанциях, на которых должны были это делать по ТТХ. Спасением в условиях кризиса стали 76-мм дивизионные и полковые орудия. Короткоствольные 76-мм полковые пушки образца 1927 года были ближе всего по весу и габаритам к противотанковым пушкам. При этом их бронебойный или даже шрапнельный выстрел был достаточно эффективным против немецких танков 1941 года.
Организационные трудности и общий неблагоприятный ход боевых действий не позволили первым противотанковым бригадам реализовать свой потенциал. Однако уже в первых сражениях бригады продемонстрировали широкие возможности самостоятельного противотанкового соединения. Уже в конце июня было принято решение о формировании отдельных противотанковых артиллерийских полков РГК. Вооружались эти полки двадцатью 85-мм зенитными пушками. В июле – августе 1941 года сформировали 35 таких полков. В августе – октябре последовала вторая волна формирования противотанковых полков РГК. Эти полки вооружались восемью 37-мм и восемью 85-мм зенитными пушками. 37-мм зенитный автомат обр. 1939 года еще до войны создавался как противотанково-зенитный и имел отработанный бронебойный снаряд. Важным преимуществом зенитных орудий также был лафет, обеспечивающий круговое вращение орудия. Для защиты расчета переквалифицированные в противотанковые пушки зенитки оснащались противоосколочным щитом.
Большие потери противотанковых пушек в начале войны привели к снижению количества противотанковых орудий в стрелковой дивизии. Стрелковая дивизия штата № 4/600 от 29 июля 1941 года имела всего восемнадцать 45-мм противотанковых пушек вместо пятидесяти четырех по предвоенному штату. По июльскому штату были полностью исключен взвод 45-мм пушек из стрелкового батальона и отдельный противотанковый дивизион. Последний был восстановлен в штате стрелковой дивизии в декабре 1941 года. Кавалерийская дивизия нового штата 1941 года имела всего шесть 45-мм пушек вместо шестнадцати по предвоенному штату. Нехватку противотанковых пушек в какой-то мере восполняли недавно принятые на вооружение противотанковые ружья. В декабре 1941 года в стрелковой дивизии штата № 04/750 взвод ПТР был введен на полковом уровне. Всего в дивизии по штату было 89 ПТР.
Бронированные гусеничные тягачи «Комсомолец» были большей частью потеряны летом 1941 года, их производство было свернуто в пользу танков. Средством тяги 45-мм противотанковых пушек стали лошади и автомашины. Существенно улучшилась ситуация со средствами тяги противотанковой артиллерии с поступлением по ленд-лизу автомобилей повышенной проходимости. Знаменитые «Виллисы» были не только автомашинами командиров, но и тягачами для 45-мм пушек.
В области организации артиллерии общей тенденцией конца 1941 года было наращивание числа самостоятельных противотанковых частей. На 1 января 1942 года в действующей армии и резерве Ставки ВГК имелись: одна артиллерийская бригада (на Ленинградском фронте), 57 противотанковых артиллерийских полков и два отдельных противотанковых артиллерийских дивизиона. По итогам осенних боев пять артиллерийских полков ПТО получили звание гвардейских. Два из них получили гвардию за бои под Волоколамском – они поддерживали 316-ю стрелковую дивизию И.В. Панфилова. Зенитные орудия постепенно изымались из противотанковых полков и возвращались в систему ПВО. Все большую роль в советской противотанковой артиллерии стала играть 76-мм дивизионная пушка ЗИС-3. Немцы называли советские 76-мм пушки «ратш-бум»: снаряд попадал в цель («ратш!») быстрее, чем долетал звук выстрела («бум!»).
1942 год стал периодом наращивания числа и укрупнения самостоятельных противотанковых подразделений. 3 апреля 1942 года последовало постановление Государственного Комитета Обороны о формировании истребительной бригады. По штату в бригаде было 1795 человек, двенадцать 45-мм пушек, шестнадцать 76-мм пушек, четыре 37-мм зенитные пушки, 144 противотанковых ружья. Следующим постановлением от 8 июня 1942 года двенадцать сформированных истребительных бригад были объединены в истребительные дивизии, по три бригады в каждой. Истребительные дивизии предполагалось использовать: 1-ю – на Юго-Западном, 2-ю – на Брянском, 3-ю – на Западном и 4-ю – на Калининском фронтах. Вскоре 1-я истребительная дивизия прошла крещение огнем под ударами операции «Блау».