Когда в Петербурге свирепствовала в 1848 году холера, Пирогов образовал в своей клинике особое отделение для холерных больных; в течение 6 недель он сделал около 800 вскрытий и результаты своих наблюдений изложил по-русски и по-французски в нескольких работах о патологической анатомии азиатской холеры. Этот труд Удостоен Академией наук большой Демидовской премии.
Среди многих ученых трудов Пирогова в петербургский период его деятельности особо выделяются; «Полный курс прикладной анатомии человеческого тела» (1843–1845); «Анатомические изображения наружного вида и положения органов, заключающихся в трех главных полостях человеческого тела» (1850); «Топографическая анатомия распилов через замороженные трупы» (1851–1854); «Операция вылущения стопы», т. н. остеопластическая операция Пирогова (1854); «Клиническая хирургия» (1854). Работы Пирогова печатались по-русски, по-французски, по-немецки и по латыни, переиздавались по нескольку раз и долгое время служили учебными руководствами не только в России, но и за границей.
«Курс прикладной анатомии» еще до окончания его был награжден Академией наук Демидовской премией по представлению знаменитого академика К. М. Бэра. В отзыве Бэра отмечалось, что «Курс» Пирогова — «подвиг истинно труженической учености, потому что автор предположил себе целью заново переисследовать и в точности изложить весь состав так называемой описательной анатомии и именно в отношении к практической медицине. Мы находим в таблицах точность и полноту исследования, верность и изящество изложения, остроумный взгляд на задачи, которые обеспечивают этому творению прочное достоинство в обширной и, в последние три столетия, столь богатой изображениями литературе анатомии; вообще мы не знаем сочинения по этой части, которое могло бы равняться или превосходило бы труд нашего соотечественника… Придает этому сочинению высшее достоинство в отношении к самой науке точное исследование предметов, которые доныне оставались менее уваженными или вовсе запущенными, по той причине, что точнейшее их рассмотрение почиталось малозначащим… Прикладная анатомия г. Пирогова есть важное по своему плану, совершенно оригинальное и самостоятельное творение; отвергнув от себя ограниченную задачу, удовлетворять только отечественной потребности, оно выступает на всемирное поприще литературы в полном уверении стяжать себе и на нем самое почетное имя; такой подвиг, в успешном довершении которого нет сомнения, не может быть отличен ничем иным, как полным венком, это само собою разумеется».
Основную мысль своей «Топографической анатомии распилов чрез замороженные трупы» Пирогов впервые изложил в 1850 году на заседании общества петербургских врачей его имени. Профессор Н. Ф. Здекауер оставил современную запись этого сообщения Николая Ивановича: «Профессор Пирогов показал несколько анатомических поперечных сечений грудной полости и ее органов. Этими сечениями стал заниматься наш знаменитый анатом в продолжение зимы. С целью представить наиточнейшим образом положение и взаимное отношение органов и тканей человеческого тела, он начал замораживать трупы и особою пилою распиливать послойно в поперечном к точному отвесу тела направлении замерзшие, как камень, части.
Вследствие этого в распилах, на расстоянии 1/2 дюйма один от другого, с точностью представлено соотношение и положение различных внутренностей, сосудов, перепонок и пр. Этот способ, которому благоприятствовала наша продолжительная зима, представляет большие выгоды. Взаимное анатомическое отношение исследуемых частей сохранялось в их естественном положении, которые обыкновенно при вскрытии полостей, вследствие давления наружного воздуха, выхода газов и жидкостей из полостей, разъединению частей при препаровке, в значительной степени изменяется».
Другой современник этого открытия, доктор А. Л. Эберман, рассказывает в своих воспоминаниях, как велась работа распилов на замороженных трупах: «Проходя поздно вечером мимо анатомического здания академии, старого, невзрачного деревянного барака, я не раз видал стоящую у подъезда занесенную снегом кибитку Николая Ивановича. Он работал в своем маленьком кабинете над замороженными распилами частей человеческого тела, отмечая на снятых с них рисунках топографию распилов. Боясь порчи препаратов, он не щадил себя и работал до глубокой ночи… Мы, люди обыденные, проходили без внимания мимо того предмета, который в голове гениального человека рождает творческую мысль. Николай Иванович, проезжая по Сенной площади, где зимою обыкновенно расставлены рассеченные поперек замороженные свиные туши, обратил на них внимание и стал замораживать человеческие трупы, делать распилы их в различных направлениях и изучать топографическое отношение органов и частей между собою».