Ливонские города при поддержке Ордена всячески препятствовали Великому княжеству Литовскому и Российскому государству расширить выход к Балтийскому морю (Литва выходила к морю лишь небольшим участком своего побережья, а Россия владела Ижорской землей, – лишенной крупных населенных пунктов территорией вдоль Финского залива между устьями рек Плюса и Сестра). К середине XVI в. стремление устранить эти барьеры стало занимать видное место в политике польско-литовского короля Сигизмунда II Августа (1548–1572) и русского правительства. С попыток Москвы военной силой принудить Орден к соблюдению достигнутых ранее между ними соглашений началась Ливонская война (1558–1583).
В мае 1558 г. русские войска взяли Нарву, ставшей на несколько десятилетий первым портом России на Балтике, а в начале следующего года заняли большую часть Ливонии. Когда в августе 1560 г. русские разгромили лучшие вооруженные силы Ордена, государство рыцарей-меченосцев в качестве самостоятельной военной силы перестало существовать. Впечатляющие успехи России заставили другие государства вмешаться в схватку в Прибалтике. Император Фердинанд I, считавшийся сеньором Ордена, обратился к царю Ивану IV с предложением прекратить войну в Ливонии, а получив отказ, объявил блокаду Российскому государству. Дания захватила эстонские острова Эзель (Сааремаа) и Муху и купила владения Курляндского епископства. Швеция утвердилась в Ревеле и стала расширять свое военное присутствие в Северной Эстонии. Литва предприняла поход на Ригу и Пярнов. Таким образом, России пришлось столкнуться уже с мощной коалицией европейских стран. На заключительной стадии войны против нее выступило и Польское королевство во главе с королем Стефаном Баторием (1576–1586). Чтобы отвлечь силы русских от Прибалтики польские правители пытались вовлечь Крымское ханство и Османскую империю в войну на южных границах России.
При общем желании противников России не допустить ее на Балтику, соперничество в разделе ливонского наследства делало их соглашения между собой временными и непрочными. Царское правительство пыталось использовать это обстоятельство. В ходе войны в Прибалтике датская корона обычно выступала его союзником против их общего врага – Швеции, что впрочем не мешало датчанам использовать затруднения России в своих торговых интересах. Иван IV (1533/47–1584) рассчитывал на поддержку Дании, пытаясь создать на Балтике собственный флот для защиты плывущих в Нарву торговых судов от шведских и польских каперов. В Копенгагене на это не пошли. В 1570 г. в Москве был провозглашен «королем Ливонии» брат датского короля – принц Магнус, которого Иван IV женил на своей племяннице. Но попытка создать в Ливонии вассальное от России государство не увенчалось успехом. Магнус, получивший еще в 1560 г. от брата владения Курляндского епископства, перешел на службу к Баторию.
В конфликте со Швецией оказалась Польша, которая стремилась к власти над Северной Эстонией в целях подчинения своему контролю торгового пути, ведущего из России на Запад по побережью Финского залива. Острые разногласия по поводу раздела земель Ливонского ордена возникли в самом Польско-Литовском государстве. Когда в 1563 г. русские войска заняли Полоцк и начали угрожать Вильне, Великое княжество Литовское оказалось на грани военно-политического краха. Влиятельные группировки польской шляхты использовали этот момент для осуществления своих давних планов – лишить Литву политической самостоятельности и открыть себе возможности для колонизации белорусских и украинских земель, входивших в ее состав. По Люблинской унии 1569 г. Польша и Литва объединились в одно государство – Речь Посполитую, где при формальном равноправии сторон главенствующая роль принадлежала полякам.
Ливонская война завершилась тяжелым поражением России, которая потеряла не только все завоевания в Восточной Прибалтике, но и уступила Швеции свою территорию, прилегающую к Финскому заливу (кроме узкого коридора вдоль реки Невы), а также часть Карелии с Приладожьем. Владения Ливонского ордена поделили Речь Посполитая и Швеция. Вся Латвия и большая часть Эстонии отошли к Речи Посполитой. Власть ее королей к началу 80-х гг. XVI в. распространилась на значительную территорию балтийского побережья, но отсутствие у Речи Посполитой большой постоянной армии и, главное, военного флота делало позиции этой державы на Балтике очень уязвимыми. Финский залив с Северной Эстонией и городами Ревелем и Нарвой оказались под властью Швеции, что гарантировало ее казне большие финансовые поступления и создавало удобный плацдарм для установления господства на северных торговых путях.