Став настоятелем, отец Исаакий не давал и себе ни в чем послабления, так же усердно нес свои монашеские подвиги. Не отразилось его настоятельство и на простоте его характера. Так, однажды совершалось в обители погребение. Братия собрались вокруг могилы, дабы отдать последний долг усопшему — с молитвой об упокоении души его посыпать земли на гроб почившего. Отец Исаакий не поспел вовремя прийти к могиле брата и потому тщетно старался проникнуть туда сквозь густую толпу братии. Когда же он, взяв одного из них за рукав, хотел с его помощью подняться на насыпанную при могиле землю, последний, не заметив настоятеля, сильно оттолкнул его руку, так что тот чуть было не упал. Отец Исаакий, нисколько не смутившись, отошел в сторону и стал смиренно ждать своей очереди. Когда стоявшие вблизи лица удивились его смиренному поступку, некоторые из братии заметили: "Да мы никогда не видали, чтобы он за подобные поступки когда-либо с кого взыскивал; по делам он наш начальник, а так держит себя, как брат".
В последние годы жизни преподобного настоятеля многие скорби выпали на его долю. Особенно тяжело пережил он отъезд старца Амвросия в Шамординскую общину. После его отбытия доходы монастыря стали резко сокращаться, так что отец настоятель по необходимости стал входить в долги, которых к концу его жизни накопилось тысяч до десяти. В разговорах с некоторыми отец Исаакий высказывался так:
"Двадцать девять лет провел я настоятелем при старце и скорбей не видел, теперь же, должно быть, угодно Господу посетить меня, грешного, скорбями".
К тому же и здоровье его начало заметно слабеть, и он келейно принял пострижение в схиму. Вскоре скончался преподобный Амвросий, и на отца Исаакия последовали тайные доносы о его неспособности управлять обителью. И хотя братия единодушно встала на защиту своего настоятеля, силы его уже угасали. Умирал он тихо, окруженный плачущими своими чадами, которым преподал последнее наставление:
"Любите Бога и ближних, любите Церковь Божию, в службе церковной, в молитве ищите благ не земных, а небесных; здесь, в этой святой обители, где вы положили начало иноческой жизни, и оканчивайте дни свои".
В июне 1894 года началась у него предсмертная болезнь дизентерия, не раз посещавшая его и прежде, которая истощила все его старческие силы. 20 августа последовал удар, после которого старец уже не мог говорить, но пребывал в сознании и причастился Святых Таин.
Преподобный Исаакий I почил о Господе 22 августа /4 сентября 1894 года.
Всечестные мощи преподобного старца Исаакия I были обретены 31 января /13 февраля 1995 года при восстановительных работах в храме Казанской иконы Божией Матери. По благословению священноархимандрита Оптиной пустыни, Святейшего Патриарха Московского и всея Руси Алексия II, в половине третьего того же дня сии святые мощи были благоговейно подняты и, по совершении литии наместником обители священноархимандритом Венедиктом (Пеньковым) с сослужащими, были перенесены в Введенский собор, где с того времени не прекращалось чтение Псалтири и совершались литии. На 3-й день после праздника Сретения Господня началось приуготовление всечестных мощей старца к их переоблачению.
Дивным смотрением Божиим накануне дня памяти святого великомученика Феодора Стратилата, которому вместе с великомучеником Георгием посвящен тот придел Казанского храма, где покоились мощи старца, перед полиелейной службой великомученику, вечером 7/20 февраля, приехал Преосвященный Стефан, епископ Пинский и Лунинецкий (впоследствии — архиепископ). Незадолго до этого владыка Стефан (Корзун) так же неожиданно был в Оптиной у всечестных мощей старцев Моисея и Антония после их обретения. После полиелея святому Феодору Стратилату владыка Стефан отслужил заупокойную литию. Невольно вспомнились слова епископа Калужского Виталия при отпевании преподобного старца Амвросия в 1891 году: "Теперь я вижу, что это старец пригласил меня на отпевание… Этот старец так велик, что его непременно должен был отпеть епископ".
Явное и преславное чудо милости Божией совершилось 6/19 февраля, вскоре по перенесении честных мощей старца Исаакия I. Очевидцами было засвидетельствовано чудо истечения святого мира от иконы Живоначальной Троицы во Введенском соборе.
Дивный во святых Своих Бог, в Троице славимый, прославил и паки прославит угодника Своего преподобного старца Исаакия, молитвами которого да обрящем и мы светлость святых.