После окончания гимназии Миддендорфа зачислили на подготовительное отделение в Главный педагогический институт, который к этому времени возглавил его отец, но Александр мечтал стать натуралистом, и в 1832 году он поступает на медицинский факультет Дерптского (Тартуского) университета. В 30-е годы в Дерптском университете преподавали многие известные ученые. Лекции по ботанике читал знаменитый Карл Ледебур, автор первой "Флоры России" и один из исследователей Алтая. Геологию вел Э. Гофман, исследователь Урала, Восточной Сибири и участник кругосветного плавания О. Коцебу на шлюпе "Предприятие". Друзьями Миддендорфа были молодые преподаватели А. Бунге - известный географ, путешественник, исследовавший Алтай и совершивший научную поездку в Китай и Прибайкалье; Р. Траутфетер - прекрасный знаток флоры России и Восточной Сибири. Ежемесячно в университете проходили собрания профессоров и преподавателей, на которых заслушивались сообщения и доклады. Студенты принимали активное участие во всех научных собраниях и диспутах.
Университетские годы еще более укрепили тягу молодого ученого к путешествиям и научным исследованиям. Позже Миддендорф вспоминал: "Еще в студенческие годы я вызвался на свой счет сопутствовать Парроту в его путешествиях к Нордкапу, но получил отказ.
Впоследствии я хватался за каждый случай, как скоро представлялась возможность ехать в Пекин, на Арарат для исследования его рушения по свежим следам. Каждый из таких случаев казался мне путеводной звездой.
Тогда я с одинаковой охотой поехал бы во внутренность Африки и к Ледовитому океану", В 1837 году Миддендорф блестяще закончил университет и получил диплом врача. Эпиграфом к своей докторской диссертации, которым немало удивил ученых коллег, он взял слова поэта и путешественника Шамиссо: "Тому, кто хочет видеть свет (чуждый цивилизации), я советовал бы запастись докторской шляпой, как самым покойным колпаком для путешествий". В этих словах он видел особый смысл - необходимость для ученого-путешественника глубоких знаний медицины. И вся дальнейшая жизнь ученого подтвердила правоту сделанного им выбора. Где бы ни бывал Миддендорф во время своих научных экспедиций: на севере Сибири или Шантарских островах, в Барабпнских степях или в Средней Азии, он всегда оставался верен клятве Гиппократа и всегда помогал всем, кто обращался к нему за врачебной помощью.
После окончания университета Миддендорф с 1837 по 1839 год совершенствует свои знания за границей (в Вене, Бреславле, Берлине). По возвращении в Россию его зачислили адъюнктом кафедры зоологии позвоночных и этнографии, на которой читался один из первых в университетах того времени курсов этнографии. Но преподавательская работа не удовлетворяла молодого ученого:
"Между тем мое неодолимое влечение к странствиям не находило удовлетворения ни в первобытном состоянии моховых болот и болотных лесов Лифляндии, ни в очень подобных им местностях Лапландии, ни в окраинах южяорусеких степей. Только силы закалились крепче и соответственно тому еще больше давали пищи внутреннему влечению. Утомительные похождения оставались по-прежнему стихией страстного охотника; опасности манили душу; жажда деятельности при свежести сил 27-летней молодости неудержимо выгоняла вон и влекла вдаль. Кто не знает этого влечения, тот не думает пускаться в путешествие для открытий на далеком Севере".
В 1840 году Александр Федорович предпринял первое свое большое путешествие в составе Новоземельскои экспедиции, руководителем которой был замечательный русский ученый-зоолог, академик Карл Максимович Бэр.
Во время экспедиций Миддендорф пересек пешком Кольский полуостров. Научным результатам экспедиции явилась публикация трех статей, посвященных географии, орнитологии и топографии этого района. В экспедиции Миддендорф зарекомендовал себя как блестящий, волевой исследователь, обладающий необходимыми навыками и умением для работы в суровых условиях Севера.
Бэр оценил блестящие способности молодого ученого и наметил его руководителем для большого путешествия в Сибирь. О таком путешествии Бэр мечтал всю жизнь, по для него самого оно было уже непосильным, и он со свойственной ему энергией добивался отправления экспедиции в Сибирь под руководством Миддендорфа.
В сентябре 1842 года Киевский университет освобождает от занятий 27-летнего экстраординарного профессора Миддендорфа, и он уезжает в Петербург для организации Восточно-Сибирской экспедиции - одного из крупнейших научных исследований XIX века. Позднее он напишет: "Радуясь счастию предаться наконец неодолимому влечению моей любимой мечты с ранней молодости, которого не могли подавить во мне разнообразные обстоятельства жизни, я немедленно отказался от пыльной кафедры в Киеве, где я тогда преподавал зоологию".
14 ноября 1842 года Миддендорф с двумя спутниками - лесничим Т. Брантом и препаратором Г. Фурманом - начинает путь в Сибирь. Путь долгий и трудный по знаменитому Сибирскому тракту через Владимир, Нижний Новгород (Горький), Казань, Пермь, Екатеринбург (Свердловск), Шадринск, Ишим, Омск, Томск, Ачинск в Красноярск. Учитывая короткое северное лето, Миддендорф стремится как можно быстрее добраться до Красноярска, чтобы оттуда отправиться на Таймыр. Небольшая остановка была сделана только в Омске, где Мпддендорф встретил Новый год и где к экспедиции присоединился унтер-офицер корпуса военных топографов В. Ваганов, а также в Барнауле, чтобы изготовить некоторое оборудование, необходимое для проведения исследовательских работ.
В начале февраля экспедиция оставила Сибирский гракт и направилась на север в Енисейск, а затем в Туруханск, где были сделаны последние поиготовления к предстоящему пуаешествию на Таймыр. 23 марта Миддендорф со своими спутниками двинулся в Дудинку, а затем в селение Коренное-Филипповское на реке Боганиде .По дороге в селе Введенском к экспедиции присоединяется еще один человек - местный житель Тит Лаптуков, знающий язык ненцев, - несмотря на свой почти семидесятилетний возраст, человек закаленный, хорошо ориентирующийся в местных условиях и, несомненно, много сделавший для успешного проведения экспедиции.
В это время в тундре свирепствовала эпидемия оспы, и целые стойбища полностью вымирали. Миддендорф как врач не мог оставить коренные народы без врачебной помощи, одновременно понимая, что в условиях короткого полярного лета любая задержка может привести экспедицию к тяжелым последствиям.
От местных жителей Александр Федорович узнал, что в низовьях реки Таймырки не кочует ни одно племя ненцев и для того, чтобы выйти к побережью, необходимо взять лодку и на ней спуститься рекой к морю. Построить лодку в тех условиях было трудно: лес находился южнее села Коренного-Филшшовского, на расстоянии одного дня пути. Почти месяц спутники Миддендорфа делали последние приготовления и строили лодку, а он сам проводил научные исследования по рекам Хете и Хатанге.
Седьмого мая Миддендорф с четырьмя спутниками - Вагановым, Лаптуковым и казаками Василием Седельниковым и Егором Лавурским - на девяти санях направляется на север к Таймырскому озеру. В верховьях реки Новой Миддендорф встречает самое северное стойбище Тойчума. Все жители стойбища к этому времени были больны оспой, а многие к приходу экспедиции погибли от страшной болезни. Из нескольких десятков человек только один мог ходить, а другой с трудом вставал. Здесь и пригодились Александру Федоровичу его знания и опыт врача. Он понимал, что им нужно спешить, но остаться безучастным не мог и десять дней лечил жителей стойбища. За это время ненцы полюбили русского шамана, как они называли Миддендорфа, и благодаря этому ему удалось достать у них оленей и купить маленький челнок, который очень пригодился в дальнейшем путешествии.