Первое выступление против Златоуста состоялось по делу так называемых «длинных братьев». Четыре монаха Нитрийской пустыни, преследуемые Феофилом как оригенисты, прибыли в Константинополь и стали просить защиты у Златоуста. Св. Иоанн отнесся к ним с участием и письменно ходатайствовал за них перед Феофилом. Но тот стал резко порицать Златоуста за вмешательство в дела чужой епархии. Тогда монахи обратились непосредственно к императору и предъявили по адресу Феофила тяжелые обвинения. Император сделал распоряжение о вызове Феофила на суд в Константинополь. Златоуст по благородству своей души уклонился от суда над Феофилом, но этот последний стал действовать как ловкий интриган. Он, со своей стороны, используя простодушие Епифания, епископа Кипрского, предъявил Златоусту обвинение в оригенизме (см. об этом подробнее у Сократа, Церк. Ист. VI, 7, 9–10, 12–14). Могущественной союзницей врагов Златоуста явилась императрица Евдоксия, которую он обличал за намерение захватить виноградник одной вдовы, напоминая ей истории пр. Илии и Иезавели. Прибывший в столицу с несколькими десятками египетских епископов (ок. 50), Феофил открыл собор в предместье Константинополя в предоставленной императором вилле под названием «При дубе» и послал вызов св. Иоанну явиться для защиты от предъявленных ему обвинений. Справедливо считая действия Феофила незаконными, св. Иоанн отказался явиться на этот собор, а преданные ему епископы в количестве 40 человек, со своей стороны, вынесли в соборном постановлении протест против действий Феофила. Не смущаясь этим, Феофил со своими единомышленниками, приведя вымышленные обвинения и используя клеветников, приговорил Златоуста к низложению. Против Златоуста выступило два обвинителя: его бывший диакон и епископ Иоанн. Все их обвинения были простым собранием сплетен, подчас смехотворных, или же были извращением действительного положения дел. Так, диакон обвинял Златоуста в преследовании его, диакона, за то, что он ударил одного из слуг; или что некий монах Иоанн был избит и закован в кандалы вместе с бесноватыми. Обвинялся Златоуст также в распродаже священных сосудов и мрамора, предназначенных для храма. Последнее, возможно, и имело место, т. к. Златоуст помогал бедным и вполне мог употребить на доброе и неотложное дело вырученные деньги (ср. житие св. Кирилла Иерусалимского). Обвиняли Златоуста, что он оскорбляет духовенство, — называет его бесчестным, распущенным. И это могло быть, только не оскорбление, а справедливое обличение. Или еще, что Златоуст избрал епископом Антониана, который, якобы, ограбил гробницу, и т. д. (всего до 29 обвинений!). Император Аркадий под влиянием Евдоксии приговор «собора» утвердил.
Чтобы не вызвать народного смятения, св. Иоанн Златоуст добровольно пошел в изгнание и был водворен в Пренете, вблизи Никомидии. Но, тем не менее, когда жители Константинополя узнали о происшедшем, то пришли в страшное волнение. Феофил спасся от народной ярости только тем, что тайно выехал из столицы. В это же время сильное землетрясение навело ужас на Евдоксию, покои которой подвергались особенной опасности разрушения. Обезумевшая от страха, императрица настояла на том, чтобы приказ о ссылке был отменен, и великий Святитель с торжеством был возвращен на место своего служения. Новый собор из 65 епископов признал неправильность возведенных на Златоуста обвинений и незаконность действий собора «При дубе».
Но вскоре новые события трагически отозвались на положении великого архиепископа. Близ храма св. Софии была воздвигнута колонна в честь императрицы Евдоксии. Торжество открытия сопровождалось празднествами, которые носили языческий характер. Шум толпы мешал богослужению. Обращение Златоуста к префекту не дало никаких результатов. Тогда он произнес яркую обличительную речь, которая начиналась словами: «Опять Иродиада беснуется, опять неистовствует, опять пляшет, опять требует у Ирода главы Иоанна Крестителя!» (VIII: 607). Евдоксия пришла в ярость и вошла в сношения с Феофилом, организуя вторичное низложение св. Иоанна. Лично Феофил не решился явиться в Константинополь, опасаясь вспышки народного гнева. Но он направил туда своих уполномоченных Севериана и Акакия, которые собрали всех врагов Златоуста и произнесли приговор о вторичном его низложении. Слабодушным императором этот приговор был утвержден, и в день Пасхи 404 г. отряд воинов ворвался в церковь, где Святитель совершал службу, произвел здесь дикое буйство и взял Златоуста под стражу. Около двух месяцев архиепископ находился под домашним заключением. Чтобы не допустить мятежа, архиепископ, простившись со своими друзьями, снова добровольно отдался в руки власти, и был вывезен в Вифинию.