Став епископом в 374 г., св. Амвросий всю свою оставшуюся жизнь посвятил служению Церкви Божией. Имущество свое он употребил на благотворительные дела и отдался аскетизму, соблюдая строжайшее воздержание и проводя дни и ночи в молитве и труде. Главнейшую обязанность епископа он усматривал в учительстве, а потому с примерным усердием изучил христианское богословие и вскоре стал прекрасным проповедником. Слушать его проповеди приходили толпы народа. Сильное действие они оказали и на молодого тогда бл. Августина.
Картину обыденной жизни св. Амвросия прекрасно описал Фаррар, опираясь на свидетельство бл. Августина. «Прежде всего, утром, — пишет он, — после своих частных молитв, он обыкновенно совершал ежедневное богослужение и св. Евхаристию. Сделав это, он садился читать за столом в своей комнате, ревностно изучал Священное Писание при помощи греческих толкователей, особенно Оригена и Ипполита, и своих современников — Дидима и Василия Великого. Он читал также с искренним восторгом творения Платона. Двери его помещения всегда были открыты, и время его вообще принадлежало его пастве. Всякий мог видеть его, и всякий мог советоваться с ним. Когда кто-либо приходил к нему с просьбой о помощи, он немедленно оставлял чтение, все свое внимание посвящал делу просителя и затем опять предавался своим научным занятиям, нисколько не смущаясь тем обстоятельством, что многие из его посетителей оставались около его помещения и с праздным любопытством следили за ним в его работе. За исключением двух дней в неделю, он ежедневно постился до вечера. По окончании своей трапезы он садился писать проповеди и сочинения, но, в отличие от большинства своих современников, он писал все собственноручно, т. к. не считал вправе утомлять других бодрствованием в течение длинных часов ночи». («Жизнь и труды свв. отцов…», т. 2, с. 103).
Св. Амвросий успешно защищал христианскую веру против язычества, имевшего еще немало последователей среди римской аристократии, и мужественно боролся с арианской партией, возглавляемой матерью императора Валентиниана II (375–393) Юстиной. Когда последняя потребовала от св. Амвросия уступить Миланскую базилику для богослужения ариан готов, служивших в наемных римских войсках, он отказался наотрез. Ответ его обосновывался тем, что собственность Бога не подлежит распоряжениям императора. «Говорят, что государю все дозволено, что его — все, — пишет Святитель, — Я отвечаю: не трудись, император, думать, что в делах Божиих имеешь императорское право; но, если хочешь дольше царствовать, будь покорен Богу. Написано: Божия Богови, кесарево кесареви. Императору принадлежат дворцы, епископу церкви» (II. 20).
Необыкновенную смелость проявил св. Амвросий во время событий в Фессалонике. Жители этого города восстали против повышения налогов. Император Феодосий (379–395) жестоко расправился с восставшими — почти все население города с детьми и стариками было согнано в цирк и истреблено. Сановники империи поздравляли Феодосия с «победой», а сенат поднес ему даже титул «отец народа». Иначе поступил Святитель: он немедленно написал письмо императору с настойчивым призывом покаяться. (Есть сказание, что св. Амвросий не пустил императора в храм до его раскаяния). Феодосий уступил требованиям Святителя — явился для принесения покаяния ко входу в храм без императорских одежд. Это событие имело большое значение в становлении на Западе отношений Церкви и светской власти.
Важнейшей заботой Святителя было духовное состояние паствы. Постоянно вращаясь среди нее, он не пропускал без внимания все ее темные стороны. Особенно его тревожили распространенные тогда пороки — корыстолюбие и алчность.
Скончался св. Амвросий в 397 г. 4 апреля в день Великой субботы и, по свидетельству биографа — его современника диакона Медиоланского Павлина, был оплакан не только христианами, но и язычниками.