Католическое влияние чувствуется в барочном иконостасе работы украинского архитектора Ивана Зарудного. Сооружение высотой в 30 метров не помещается в основном объеме собора, и верхняя его часть уходит в подкупольное пространство. Отдельные части иконостаса вырезаны из липы и мореного дуба московскими резчиками. В соборе они монтировались, покрывались гипсом, рыбьим клеем, позолотой. Собрали все только в 1726 году. Колоссальной величины арка царских врат, круглые скульптуры, эффектная арка, похожая на беседку, - все это абсолютно не похоже на русские иконостасы и напоминает скорее соборы Мюнхена и Праги. Всего здесь 43 иконы московской школы. Две большие иконы по обе стороны царских врат изображают Богоматерь с Младенцем (по преданию, имеющую портретное сходство с Екатериной I) и Иисуса в патриаршей тиаре и одежде московских царей. Икону с апостолом Петром, расположенную над надгробием императора, окружают четыре малые иконы с изображением князей-святых: Борис, Глеб, Александр Невский, царевич Дмитрий. Перед иконостасом находятся кафедра (на ней вырезаны фигуры титульных святых собора - апостолов Петра и Павла) и царское место - возвышение, на котором стояли во время службы императоры.
Порывая с Москвой, Петр перенес из кремлевского Архангельского собора в еще недостроенный Петропавловский династическую усыпальницу Романовых. Первое исторически достоверное захоронение в соборе относится к 1715 году, когда здесь в присутствии Петра и Екатерины была погребена их двухлетняя дочь Наталья. Отдельно, под колокольней, рядом с входом, захоронен запытанный в крепости насмерть царевич Алексей, его жена кронпринцесса Шарлотта и сестра царя Мария Алексеевна.
В феврале 1725 года в собор внесли гроб самого Петра. Траурная церемония прошла с невиданным в России размахом: это был мрачный карнавал, в котором участвовали двор, генералитет, гвардия, высшие чиновники и князья церкви. По окончании литургии вице-президент Синода, религиозный реформатор и писатель Феофан Прокопович, произнес "Слово на погребение Петра Великого": "Что се есть? До чего мы дожили, о россияне! Что видим? Что делаем? Петра Великого погребаем! Не мечтание ли се?" По словам современника, слово его "беспрестанно было прерываемо плачем и воплем слушателей. Вопль и рыдание перешло вне церкви к стоящим, и казалось, что самые стены церкви и валы крепости взревели".
Шесть лет гроб Петра стоял в деревянной временной церкви, специально сооруженной в еще неоконченном соборе, и только в 1731 году его предали земле у правого крыла иконостаса. Церемониал захоронения первого русского императора определил порядок похорон царствующих особ в Петропавловском соборе. Здесь покоятся все русские императоры за двумя исключениями: Петр II переехал с двором в Москву, умер там и погребен в Архангельском соборе Кремля, а Иоанн VI, низвергнутый младенцем с престола, предан земле, вероятнее всего, в Шлиссельбургской крепости, где был заточен и убит стражей при попытке бегства. Впрочем, Петр iii, лишившийся трона в результате дворцового переворота, первоначально был похоронен в Александро-Невской лавре, и только в 1796 году его прах по приказанию сына - Павла I- перенесли в собор. Это произошло одновременно с погребением Екатерины II, причем корону перед гробом Петра III нес один из его убийц, Алексей Орлов.
Всего в соборе (без придела) - 41 надгробие: здесь похоронены 11 императоров и царствовавших императриц, императрицы - жены Павла I, Александра I, Николая I и Александра II, плюс 26 великих князей и княгинь. Каждое захоронение - в отдельном склепе. Все надгробия (они приобрели единообразную форму в 1864 году) - из белого каррарского мрамора. Исключений только два: массивные гробницы над могилами Александра II и его супруги, Марии Александровны. Памятник на могиле императора сделан из зеленой волнистой яшмы, императрицы - из розового с жилками орлеца. Прямыми аналогами послужили гробница, найденная при раскопках Десятинной церкви в Киеве, и саркофаг над погребением святой Ирины в Константинополе. Надгробья Петра I, Екатерины I, Анны Иоанновны, Елизаветы Петровны, Петра III и Екатерины II - по правую сторону от алтаря; Павла I, Александра I, Николая I - по левую сторону. Александр II и Александр III похоронены у северной стены собора.
Великих князей и княгинь отпевали и хоронили в северо-западном углу собора, в приделе святой Екатерины, освященном в 1811 году. Это была единственная часть собора, отапливавшаяся зимой; вообще же, по словам причта, "братия немало претерпевает нужду, да и слушателей проповедей для нестерпимой стужи бывает весьма мало". В 1998 году в Екатерининском приделе были преданы земле останки жертв екатеринбургского расстрела 1918 года - Николая ii, императрицы Александры Федоровны, великих княжон Ольги, Татьяны и Анастасии, семейного врача Е.Боткина, повара И.Харитонова, лакея А.Труппа, комнатной девушки А.Демидовой. В приделе находится и захоронение царицы Марфы Матвеевны, золовки Петра I, жены его брата Ивана v; она была похоронена на этом месте еще в 1715 году.