Открытие Флемингом лизоцима сопровождалось огромной радостью, сменившейся полным разочарованием. Хотя этот фермент успешно боролся с некоторыми микробами, на патогенные бактерии он не действовал никак. Показав Прайсу свою чашку Петри, он воодушевился. Понимая, что это нечто неординарное, он сфотографировал чашку и обработал парами формалина. Освоив необходимые методы, он стал получать обнадеживающие результаты. Они показали, что «сок» пенициллиновой плесени эффективно подавлял самые опасные бактерии в чашках Петри, но был неэффективен против некоторых видов бактерий, в частности «бациллы Пфайфера». Это очень важная бактерия, которая теперь называется Haemophilus influenza, поскольку ошибочно считалось, что она вызвала вспышки гриппа, унесшего жизни более 20 миллионов европейцев в 1918–1919 годах (на самом деле она вызывает менингит и некоторые другие серьезные инфекционные заболевания). Однако, видя эффективность пенициллина по отношению к множеству других бактерий, Флеминг не мог не думать на этом этапе, что пенициллин — «прекрасный антисептик». Поэтому он поставил эксперименты на поток, надеясь в скором времени перейти к клиническим испытаниям.
Сначала он проводил опыты со смесями, содержащими сыворотку крови, чтобы понять, отличает ли пенициллин бактерии от клеток организма. К большому его удовлетворению, кровяные клетки выживали. Тем не менее именно на этом этапе у него возникли первые сомнения. «Плесневому соку» требовалось несколько часов, чтобы убить бактерии в сыворотке. Более того, всего через пару часов он терял свои бактерицидные свойства. Отложив сомнения в сторону, Флеминг ввел пенициллин здоровым подопытным животным. У них никаких побочных эффектов не развилось. Однако пробы крови показали, что лекарственный потенциал пенициллина терялся за считаные минуты.
Флеминг до этого демонстрировал, что вне организма требуется четыре часа, чтобы бактерии погибли. Поэтому ему пришлось признать, что терапевтические свойства пенициллина весьма ограниченны. Десятью годами позже врачи и медицинские сестры столкнутся с той же проблемой. Поначалу влияние пенициллина на инфицированные раны будет огромным, однако для полного излечения требовалось столько пенициллина, что его запасов у врачей не хватало, и пациент, оплакиваемый медперсоналом, умирал. В конце концов, проблему могло бы решить массовое производство пенициллина. Однако в 1928 году Флеминг, причем не без оснований, почувствовал, что его исследования могут закончиться ничем.
Энтузиазм сохранялся у Флеминга довольно долго, и он даже принял на работу двух молодых биохимиков, чтобы решить проблему производства чистого пенициллина. Фредерик Ридли и Стюарт Крэддок приступили к работе в начале 1929 года. Тем не менее уже тогда стало ясно, что интерес Флеминга начинает остывать, да настолько, что он даже не стал искать для своих биохимиков необходимого помещения. К неудобству всего остального персонала, работавшего в здании, их лабораторный стол поставили в коридоре прямо перед входом в туалеты. Оба играли в регби в местной команде и обладали могучим телосложением, что добавляло еще больше неудобств тем, кто хотел пройти мимо них.
Несмотря на условия, далекие от идеальных, Крэддок и Ридли достигли хороших результатов. Некоторое время спустя, они получили «плесневый сок», обладавший такой же лечебной силой, как и тот, который Флори впоследствии будет использовать в клинических испытаниях. Крэддок и Ридли также показали, что, если держать пенициллин в слабокислой среде и при низкой температуре, то его полезные свойства сохраняются в течение нескольких недель. Это полностью опровергает поздние заявления Флеминга о том, что пенициллин не мог быть получен в 1929 году «из-за его нестабильности», а успех оксфордской группы после 1940 года объясняется появлением к тому времени метода сублимационной сушки. Оба утверждения далеки от истины. К 1929 году у группы Флеминга было достаточно пенициллина и знаний о том, как его сохранять, чтобы провести опыты с инфицированными животными. Если бы это было сделано, то он бы обязательно пришел к использованию пенициллина в виде внутривенных инъекций. Однако Флеминг, Крэддок и Ридли даже не попытались испытать пенициллин на животных, поскольку считали это пустой затеей.