После Пасхи 1891 года старца постигла новая неожиданная скорбь. Избранная им настоятельница обители м. Евфросиния, его ближайшая помощница и исполнительница его предначертаний, тяжко заболела. Войдя однажды в его келлию по какому-то делу, она вдруг почувствовала себя очень нехорошо. Лицо ее помертвело, дыхание прекратилось, она едва не упала. Смутился старец. Сам, еле передвигая ноги, подошел к видимо умиравшей, затем позвал сестер, которые и уложили ее на стоявший вблизи диван; тогда старец, глядя на нее и как бы прося ее не покидать его, удрученного болезнями и скорбями, сказал дрожащим от волнения голосом: «Мать, подыши еще!» И скоро, по молитвам старца, дыхание ее возобновилось, и она была приобщена Св. Христовых Таин. После этого случая м. Евфросиния стала слепнуть. К средине лета она уже ничего не могла видеть, ― могла только различать белый цвет от черного. Тяготясь, вследствие потери зрения, должностью настоятельницы, она просила старца позволить ей подать прошение об отставке, но старец не благословил, сказав: «Сама не подавай, а если велит подать начальство, то подай». При этом он старался всячески утешать ее и ободрять, говоря: «Мать! Претерпевай и не унывай!» В довершение всех скорбей старца обрушилось на него и неблаговоление епархиального начальства, особенно обострившееся к концу его жизни. В 1890 году в Калугу был назначен новый архиерей, перемещенный из Тамбова, преосвященный Виталий. Прибыл он на епархию осенью, когда старец Амвросий уже имел свое пребывание в Шамординской общине. Преосвященному Виталию очень хотелось видеть известного всему православному миру старца Амвросия, но, узнав, что старец живет в женской обители, медлил ехать в Оптину пустынь, ожидая возвращения старца в скит. Между тем время шло, а старец не возвращался. Это было неприятно владыке, тем более, что старец переместился в Шамордино без разрешения своего епархиального начальства.
Распространявшиеся недоброжелателями о. Амвросия нелепые о нем слухи по поводу его пребывания в Шамордине доходили и до владыки и смущали его еще более, так что он даже говорил с тревогою: «Что это у них там делается?», ― и несколько раз поручал благочинному монастырей потребовать от старца немедленного возвращения в свой скит. Болезненный, умирающий старец, конечно, не мог исполнить этого распоряжения, но в Калуге не верили этому и принимали его слова за одну пустую отговорку. Старцу стали угрожать, что его силою отвезут в Оптину, на что он отвечал: «Я знаю, что не доеду до Оптиной; если меня отсюда увезут, я на дороге умру».
Собственно говоря, епархиальному начальству не было никакого основания волноваться и можно было бы относиться к старцу с тем же доверием и благоговением, с каким относился к нему, например, великий молитвенник о. Иоанн Кронштадтский, говоривший приезжавшим к нему шамординским сестрам: «А, это от старца Амвросия; о, великий старец! Земной поклон ему от меня!» Но, очевидно, кому-то нужно было омрачить последние дни земной жизни о. Амвросия, увеличить тяжесть несомого им креста, так что на нем исполнялись слова Господа: «Блажени изгнани правды ради: яко тех есть Царствие Небесное. Блажени есте, егда поносят вам, и ижденут, и рекут всяк зол глагол на вы лжуще, Мене ради. Радуйтеся и веселитеся, яко мзда ваша многа на небесех: тако бо изгнаша пророки, иже беша прежде вас». (Мф. 5, 10–12). Возлюбив свое последнее и любимейшее детище, Шамординскую обитель, своею последнею и сильнейшею любовью, старец, претерпевая за эту обитель великие скорби, тем самым показал, что возлюбль своя сущия в мире, до конца возлюби их. (Ин. 13, 1), возлюбил не словом ниже языком, но делом и истиною (1 Ин. 3, 18). Весною разнесся слух, будто владыка, расстроенный разными толками и сообщениями, сказал: «Я сам поеду в Шамордино, посажу старца в карету и увезу в Оптину!» Когда одна из духовных дочерей старца передала ему эти слова преосвященного, о. Амвросий ответил: «Жив Господь Бог мой, и жива будет душа моя; а ты знай, что над всеми владыками есть Вышний Владыка; ехать в Оптину я не собираюсь; да и куда я теперь поеду?! Разве только…» И старец последние слова сказал так тихо, что их невозможно было расслышать. Другая монахиня, также встревоженная ходившими слухами, обратилась к старцу: «Батюшка! Говорят, владыка сюда едет; что вы ему скажете?» ― «Я скажу, ― тихо ответил старец, ― я скажу: ищите прежде воли Божией…»