В декабре 1845 года о. Амвросий был рукоположен в иеромонаха. Для рукоположения пришлось ему ехать в Калугу на лошадях. Был сильный холод. Отец Амвросий, приехав на первую же станцию, почувствовал сильную боль в желудке, и это было началом всех его последующих болезней. По возвращении в Оптину о. Амвросий чувствовал себя постоянно нездоровым, но все-таки не оставлял чреды священнослужения. Однако по временам он бывал уже так слаб, что, как после сам вспоминал, не мог долго держать потир одной рукой. «Однажды много было причастников ― рассказывал он. ― Преподавая Пречистые Тайны Христовы одной рукой, другою я держал потир. И вот почувствовал я, что рука моя стала слабеть и неметь. Чтобы несколько дать отдых руке, я пошел в алтарь поставить на малое время на престол св. Чашу, а вслед за мной слышу голос какой-то женщины, подходившей к причащению: „Знать я, грешная, недостойна!“ ― Ах, Боже мой, подумал я, тесно мне отовсюду!»
В начале сентября 1846 года о. Амвросий еще выезжал по Белевской дороге за 18 верст от Оптиной навстречу Курскому архиепископу Илиодору, которого он должен был пригласить посетить обитель, а семнадцатого сентября заболел так серьезно и пришел в такое изнеможение, что 26 октября во время утрени был особорован и приобщен Св. Христовых Таин. В это же время он был келейно пострижен в схиму с сохранением имени Амвросия. Эта тяжкая болезнь продолжалась более года и имела очень большое значение для внутренней духовной жизни о. Амвросия. Чувствуя крайнюю слабость и потеряв надежду на улучшение своего здоровья, о. Амвросий в декабре 1847 года подал прошение об оставлении его в обители за штатом. Исследовавший состояние его здоровья, по поручению Духовной консистории, козельский врач Субботин дал такой отзыв о его болезни: «Отец иеромонах Амвросий имеет болезненный желтый цвет лица, с болезненно-блестящими глазами, всеобщую худобу тела; при высоком своем росте и узкой грудной клетке ― сильный, больше сухой кашель, с болью при нем в груди, боль в подреберных сторонах, преимущественно в правой; нытье под ложкой и давящую боль в стороне желудка; совершенное расстройство пищеварения, упорные, постоянные запоры и частую рвоту не только слизями и желчью, но и принятою пищею; бессонницу и, наконец, повременный озноб к вечеру, сменяющийся легким жаром. Припадки эти означают медленную изнурительную лихорадку, происшедшую вследствие затвердения брюшных внутренностей, преимущественно же желудка». На основании этого отзыва уездного врача Калужское епархиальное начальство признало иеромонаха Амвросия неспособным ни к каким монастырским послушаниям и постановило исключить его, как неспособного, из штата братии Оптиной пустыни, оставив его на пропитании и призрении обители. В это время о. Амвросию было всего только 36 лет.
Таким образом, несмотря на столь молодые годы о. Амвросия, земная деятельность его, по обычным человеческим соображениям, казалась уже совершенно закончившейся. Разбитый тяжкою болезнью, признанный неспособным ни к какому полезному труду, он должен был доживать свой век инвалидом на иждивении приютившей его обители. Но, видно, мысли наши ― не мысли Божии, и пути наши ― не пути Божии. То, что человеческому рассуждению представлялось концом жизни и деятельности, на самом деле было, быть может, началом, зародышем и основанием новой, истинной, высокой жизни. На о. Амвросии исполнялись слова Господа «аминь, аминь глаголю вам, аще зерно пшенично пад на земли не умрет, то едино пребывает: аще же умрет, мног плод сотворит» (Ин. 12, 24).
Эта тяжкая и продолжительная болезнь была, в действительности, лишь новым действием Промысла Божия, столь явно обнаруживавшегося в жизни о. Амвросия. Подобная же тяжкая болезнь, перенесенная им в семинарские годы, впервые заставила его серьезно подумать о монашестве.
Промысл Божий привел его к Троекуровскому старцу Илариону, внушил ему желание побывать у св. мощей преп. Сергия, направил его путь в Оптину пустынь и поставил его здесь под духовное руководство великих светильников истинного монашества о. Леонида и о. Макария.
И вот, когда в душу о. Амвросия глубоко запало посеянное этими старцами семя духовной жизни, Промысл Божий находит необходимым как бы отстранить о. Амвросия от всякого рода общественной деятельности, приковать его к одру болезни, удалить от него все внешние впечатления, поставить его лицом к лицу лишь со своими страданиями и с Богом… Для чего? Для того, чтобы воспринятое им в свою душу семя новой жизни растворилось там, переработалось, вошло, так сказать, в его плоть и кровь, пустило там ростки и корни и стало живым достоянием всего его нравственного существа.