Святитель Московский Филарет, хорошо знавший дела оптинские, писал по поводу кончины о. Макария: «Оптинские лишились о. Макария. Думаю, остались от него добрые духовные наследники; но найдется ли, кто мог бы поддержать их в единстве духа и возглавить?»
Таким образом, определенного преемника о. Макарию по старчеству после его кончины не было. Обращавшиеся к о. Макарию при его жизни за наставлениями и руководством избрали себе различных руководителей. Отец архимандрит Моисей избрал своим духовником и старцем своего брата игумена Антония; иные обратились к новому скитоначальнику о. Пафнутию, ставшему вместе с тем и духовником обители; другие избрали своим старцем иеромонаха Илариона, бывшего последние годы келейником о. Макария; а иные, наконец, сделались учениками о. Амвросия. Как высоко уже в это время многие ставили о. Амвросия, видно из следующих отзывов о нем.
Один из духовных сыновей о. Макария, К. К. Зедергольм, о котором мы скажем подробнее ниже, писал 17 ноября 1860 г. своему брату: «Осиротели мы с тобою (после смерти о. Макария). Доселе мне кажется, что с батюшкою о. Макарием скончалось все утешение мое. Обращаюсь к о. Амвросию, истинному ученику батюшки, проникнутому его духом». В 1861 году инспектор Томской духовной семинарии иеромонах Владимир в письме к о. архимандриту Моисею выражал радость, что его брат, принятый в Оптину пустынь, «удостоился получить в духовные руководители такого старца, как о. Амвросий!» Около того же времени иеромонах Антоний (Бочков) писал об о. Амвросии, что обитель Оптинская «от него получает укрепление и назидание. Причиною тому служат: его кротость, доброта и простота. Его благой пример и советы могут сотворить чудо… Хвалить его напрасно. Дела лучше слов говорят за него… Видно, назначено ему спасаться болезнями; редкое его незлобие и младенчество христианское все переносить благодушно: и Божие наведение, и человеческие неправды». Преосв. Вениамин, епископ Воронежский, приезжавший еще при жизни о. Макария в Оптину, долго беседовал с о. Амвросием, и всегда после того относился к нему с глубоким уважением.
С течением времени слухи о духовной опытности и мудрости о. Амвросия все более и более распространялись, и число относящихся к нему все более возрастало. Относившиеся на первых порах, по неведению, к о. Амвросию с недоверием, стали изменять о нем свое мнение.
Так одна барыня, глубоко огорченная кончиною о. Макария, услышав, что в Оптиной пустыни есть теперь новый старец, о. Амвросий, воскликнула: «Как! Чтобы я после Макария пошла к этому монаху, который все вертелся в батюшкиных келлиях и расхаживал с мешочком! Это невозможно!» Но спустя некоторое время, случайно побеседовав с о. Амвросием, она вышла от него растроганная и впоследствии говорила: «Я знала обоих, но чувствую, что о. Амвросий еще выше о. Макария».
В 1862 году скончался настоятель Оптиной пустыни о. архимандрит Моисей. Преемником ему старшая братия, большинством голосов, избрала скитоначальника о. Пафнутия. Однако преосвященный Григорий не утвердил этого избрания, так как был осведомлен от о. Амвросия, что преемником о. Моисея, по указанию о. Макария, должен быть скитский иеромонах Исаакий; его-то и назначил преосвященный настоятелем обители, пообещав о. Пафнутию не оставить и его, что и исполнил вскоре, определив его настоятелем Малоярославецкого монастыря.
С перемещением о. Пафнутия в Малоярославец многие из его духовных детей стали теперь относиться к о. Амвросию. В 1865 году скончался брат архимандрита Моисея о. игумен Антоний, последний из великих оптинских старцев ― устроителей скита. Его ученики также в значительном числе обратились к о. Амвросию, ― и с этого времени в Оптиной пустыни явилось, таким образом, два главных духовных руководителя: о. Амвросий, старец, и о. Иларион, духовник братства.
К этому времени о. Амвросий становится уже известным и святителю Московскому Филарету, который в том же 1865 году, с одним бывшим в Москве оптинским монахом, прислал старцу на благословение образок Нерукотворного Спаса.