Вскоре после этого она получила горестную весть о кончине ещё одного своего друга, чью судьбу сломало разрушение Рима. Кастильоне в качестве посла при мадридском дворе сделал всё возможное, чтобы утихомирить гнев императора и спасти несчастного папу. Однако его усилия были обречены на провал. Сам Карл V не ожидал такого поворота событий. Тем не менее, горькие упрёки, которые Климент VII обрушил на голову больного графа, добили его. Даже благосклонность императора не смогла его утешить, и, протянув ещё одно лето, Кастильоне умер в Толедо 7 февраля 1529 года. Выслушав новость о его кончине, Карл V повернулся к своим придворным и с искренним сожалением произнёс:
– Мы потеряли одного из величайших кавалеров в мире.
В родной Мантуе смерть Кастильоне была воспринята с величайшей скорбью не только его престарелой матерью, которая одна осталась опорой своим внукам-сиротам, но и друзьями, которых он так любил. А в его любимой лоджии так и не дождались графа. Джулио Романо воздвиг в церкви Санта Мария делле Грацие надгробие своему старому покровителю, а Изабелла оплакивала в нём самого опытного из своих придворных и самого верного из своих друзей.
В марте 1529 года Альфонсо д'Эсте снова прислал в Мантую Тициана с письмом, сердечно рекомендуя этого любимого мастера своему племяннику, но умоляя его не задерживать слишком долго. По заказу Федерико II художник написал несколько картин, в том числе, самый знаменитый портрет герцога с любимой болонкой и портрет его матери («Изабелла в красном»). Несмотря на то, что время не пощадило лица и фигуры пятидесятипятилетней маркизы, её взгляд поражает своей живостью и умом. Позднее Федерико заказал художнику ещё один портрет своей матери в молодости («Изабелла в чёрном»), который по праву считается шедевром Тициана. Сама же маркиза так отозвалась о своём последнем портрете:
– Он настолько хороший, что я сомневаюсь, что в этом возрасте я могла быть такой красивой.
Едва стихли звуки свадебных торжеств, как произошли события, которые изменили всю политику Альфонсо I. Катастрофический результат французского вторжения в Неаполь и смерть главнокомандующего Лотрека от чумы оказались фатальными для амбициозных планов Франциска I. Папа сразу бросился в объятия императора и после длительных переговоров 29 июня 1529 года был заключён Барселонский договор. По этому соглашению понтифик должен был вернуть себе утраченные владения, включая Модену и Реджо, а Алессандро Медичи, внебрачный сын покойного Лоренцо (или, по слухам, самого Климента VII), должен был стать герцогом Флоренции. Поражение французской армии в Ломбардии разрушило последние надежды Франциска I, и в августе в Камбре тётка императора, Маргарита Австрийская, и мать короля Франции, Луиза Савойская, подписали мирный договор. По этому соглашению Карл V сохранил за собой Неаполь и Милан.
Триумф императора был полным, и 12 августа он высадился в Генуе, где впервые ступил на итальянскую землю. Местом встречи папы и Карла была выбрана Болонья. Климент послал кардинала Эрколе Гонзага встретить императора вместе с двумя молодыми Медичи, Алессандро и его кузеном Ипполито, который в возрасте восемнадцати лет вместо того, чтобы жениться на Изабелле Колонна, был назначен кардиналом. Но прежде, чем Карл отправился в своё путешествие, герцог Феррары, желая угодить всемогущему монарху, попросил его выбрать более короткую дорогу через Реджо и Модену и предоставил себя и своих подданных в его полное распоряжение. Альфонсо сам выехал навстречу Карлу близ Реджо и так красноречиво отстаивал свои интересы, что император не только принял его приглашение, но и провёл несколько дней в его обществе. Тем временем Изабелла, осознавая всю важность события и понимая, насколько велики стоящие на кону проблемы, решила сама посетить Болонью и лично встретиться с императором.