В последний год своей супружеской жизни Мария Фёдоровна была явно озабочена физическим состоянием государя, который становился всё более раздражительным и капризным. В мае 1800 года она писала Нелидовой: «Наш образ жизни невесел, так как совсем невесел наш дорогой государь.
Он носит в душе глубокую печаль, которая его снедает. От этого страдает его аппетит... и улыбка редко появляется на его устах».
Словно предчувствуя насилие, которое будет совершено над ним, Павел I нигде не чувствовал себя в безопасности, даже в собственном дворце. Ему для спокойной жизни нужен был укреплённый замок, окружённый глубоким рвом, заполненным водой, с толстыми стенами и с подъёмными мостами, абсолютно недоступный. Для него воздвигли срочно такой замок, поселившись в который царь создал себе иллюзию своей полной безопасности. Крайне ограниченный придворный персонал сокращался всё больше и больше. Павел I почти никому не доверял, разве что новому генерал-губернатору столицы графу Палену. Вот он-то и возглавил заговор против государя. Говорили потом, что на осуществление плана заговорщиков Палён получил согласие от старшего сына императора, якобы согласившегося с отречением отца, но без угрозы для его жизни.
Александра заверили, что наследником престола Павел I якобы хочет объявить приглашённого им в Петербург месяц назад племянника своей супруги тринадцатилетнего вюртембергского принца Евгения. Его он намеревался женить на своей любимой дочери Екатерине. Но всё это, может быть, было придумано для оправдания злодейского убийства царя.
В ночь на 11 марта 1801 года в Петербурге в ненастную погоду, когда из-за тумана в нескольких шагах ничего не было видно, Павел I был задушен в собственной спальне. Марии Фёдоровне же было сказано, что государь скоропостижно скончался от апоплексического удара. Услышав это, бедная женщина лишилась чувств.
Лишь через шестьдесят лет события этой трагической ночи были преданы гласности. Они были описаны в книге «Цареубийство 11 марта 1801 года», составленной на основе воспоминаний участников переворота.
Когда заговорщики, предварительно изрядно выпив для храбрости, ворвались в спальню императора, в постели его не оказалось. Решили, что, услышав шаги, он успел выбежать из комнаты. Но тут один из ворвавшихся издал радостный крик — из-за заслонки камина виднелись босые ноги государя. Его силой вытащили и, протянув заранее составленную бумагу, велели немедленно подписать своё отречение от престола. В кальсонах и нижней полотняной рубахе, стоя перед пьяными офицерами, Павел I твёрдым голосом заявил, что подписывать ничего не будет. Один из заговорщиков схватил с письменного стола золотую табакерку и бросил её в царя, попав ему прямо в висок. Павел I упал, и кто-то из заговорщиков, сняв офицерский шарф императора, висевший над его скромной походной кроватью, задушил его. Так сорок лет назад это случилось и с его отцом, Петром III, хотя тот и согласился беспрекословно на отречение в пользу принцессы Ангальт-Цербстской, своей супруги.
Всех этих подробностей императрица Мария никогда не узнала, хотя истинная причина смерти её дорогого Павлуши ей стала известна.
17 марта тело покойного императора было перенесено в тронный зал Михайловского замка, а через неделю — в Петропавловский собор, где состоялось отпевание и погребение. После похорон Мария Фёдоровна удалилась в Павловск.
Первое время она была словно в шоке, ни с кем не хотела видеться, даже со старшим сыном, заменившим отца на российском престоле. Ей успели нашептать, что он как-то причастен к убийству отца, но верить во всё это мать, естественно, не хотела. Знал или не знал её первенец о предполагаемом убийстве? С его ли согласия совершилась эта трагедия? Никто не дал прямого ответа на эти вопросы. Да и историки отвечают на них уклончиво: не знал, но догадывался, не хотел, но не противился и оттого всегда чувствовал вину перед матерью. Да и что для бывшей принцессы Вюртембергской это могло изменить. Её дорогого Павла больше не было...
Любое горе лечится лишь временем. Мария Фёдоровна, теперь уже вдовствующая императрица, уединилась в своём Павловске, ограничив круг своего общения до минимума. Вставала рано, занималась своим садом, ежедневно совершала прогулку верхом в сопровождении гофмаршала и пажа. Последнему она давала кошелёк с деньгами, которые тот по её приказанию вручал какому-нибудь инвалиду и просил помолиться его за упокой души усопшего. В Павловском дворце рядом со спальней Марии Фёдоровны находилась комната, которая всегда была заперта. Входить в неё могли лишь сама вдовствующая императрица да старичок придворный, который верно служил ещё её мужу. В этой комнате хранились вещи покойного императора Павла I из его кабинета-спальни: стулья, кресло, письменный стол, на котором лежали бумага, перья и письма, стенные часы со стрелкой, остановленной на половине первого — время, когда окончилась его жизнь. За ширмочкой стояла узкая походная кровать убитого, под одеялом простыня и ночная рубашка с пятнами крови. В глухой чаще павловского парка вдова императора велела воздвигнуть мавзолей «Супругу-благодетелю, на вечную память о нём». А ежегодно 11 марта устраивалась панихида по убиенному, на которой присутствовали все члены большой семьи Марии. Память о муже она чтила всю жизнь.