Ткани брались сразу после забоя на лед и гомогенизировались в охлажденном стеклянном гомогенизаторе с охлажденным 0,15 М раствором КС1 в соотношении 1 : 10. Гомогенат центрифугировали 20 минут при 4000 об/мин. и центрифугат разбавляли водой до нужной концентрации.
Активность Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д определялась опектрофотометрическим методом в нашей модификации (1).
Реакционная смесь имела следующий состав: 1 мл 0,3 М буфера+0,2 мл 1 М MgSO4 + 0,2 мл 0,002 М НАДФ + 0,2 мл гомогената+1 мл воды (в пустые пробы — 1,4 мл). Реакцию начинали добавлением 0,4 мл 0,002 М раствора субстрата (глюкозо-6-фосфата или 6-фосфоглюконата). В качестве контрольных к пробам с глюкозо-6-фосфатом были взяты пробы, в которые добавлялся 6-фосфоглюконат в концентрации 0,001 М (объяснение см. 1). Инкубация проводилась в течение 15 минут при 37°. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 1,2 н NaOH. Выпадающий осадок Mg(OH)2, увлекающий за собой все взвешенные частицы, удалялся центрифугированием, и в прозрачном центрифугате определялась оптическая плотность при 340 мμ.
Для определения активность Г-6-Ф-Д использовался глицил-глициновый буфер рН — 9,5, а для 6-Ф-ГЛ-Д — рН — 8,5.
Калибровочная кривая строилась по раствору НАДФ — Н2 в 0.1 н NaOH. Активность ферментов выражалась в наномолях НАДФ, восстановленного за 1 мин., на 1 мг растворимого белка.
Как видно из таблицы 1, активность Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д в печени заметно снижается при голодании. Это снижение более выражено у крыс, находившихся перед голоданием на высокоуглеводной диете. Активность Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д в мозге также имеет тенденцию к снижению, но разница в этом случае статистически недостоверна.
Возобновление кормления после голодания сопровождалось выраженными морфологическими изменениями в печени. Вес печени значительно увеличивался (5,5% от веса тела против 3,8% в норме). Макроскопически и микроскопически у таких крыс найдена выраженная жировая инфильтрация печени.
Таблица 1
Активность Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д в печени и мозге при голодании
Таблица 2
Активность Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д в печени и мозге при возобновлении кормления
Таблица 3
Активность Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д в печени и мозге крыс, находившихся на разных диетах
В таблице 2 показаны изменения активности Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д при возобновлении кормления крыс после голодания. Активность ферментов-в печени значительно возрастает после возобновления кормления в 2—3 раза, превосходя их активность в печени контрольных (не голодавших) крыс. Это возрастание наблюдается не только на высокоуглеводной и сбалансированной, но и на малобелковой диете. Активность Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д в мозге после возобновления кормления находится в общем в пределах нормы. Небольшие отклонения в полушариях мозга на высокоуглеводной и малобелковой диете и в стволовой части мозга на сбалансированной диете, незакономерны и по-видимому случайны.
В таблице 3 сравнивается активность Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д в печени и мозге не голодавших крыс, находившихся на различных диетах. Активность обоих ферментов в печени крыс, находившихся на высокоуглеводной диете, была выше, чем на сбалансированной. В печени крыс, находившихся на малобелковой диете, активность Г-6-Ф-Д была ниже, чем на сбалансированной; для 6-Ф-ГЛ-Д это снижение не было выражено.
Большинство авторов (2, 7, 10-12, 20, 28) нашло при голодании небольшое снижение активности Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д в печени или даже не нашло снижения (5, 23, 29, 30). Однако, в некоторых работах (4, 6, 8, 16, 24, 25, 31, 32) было обнаружено очень сильное уменьшение активности этих ферментов в печени голодавших крыс. Вероятно, эти разногласия можно объяснить различием предшествовавшей голоданию диеты. Как было показано (5), голодание после сбалансированной диеты не влияет на активность Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д в печени, тогда как голодание после предшествующей диеты, богатой глюкозой, сопровождается снижением активности этих ферментов. К такому же выводу можно прийти и на основании наших опытов, в которых голодание после сбалансированной диеты вызывало менее выраженное снижение активности Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д в печени, чем голодание после высокоуглеводной диеты.
Многочисленными работами (2, 8, 9, 12, 13, 19, 20, 22-2, 3) было показано, что активность Г-6-Ф-Д и 6-Ф-ГЛ-Д в печени значительно увеличивается при возобновлении кормления после голодания. Величина этого повышения зависит от характера диеты в период возобновления кормления (2, 8, 9, 12, 13, 18); оно, как правило, более выражено на высокоуглеводной диете. В то же время возобновление кормления малобелковой диетой не вызывает увеличения активности этих ферментов в печени (2).