С приличной долей приближения можно сказать, что протяженная двухцепочечная ДНК одномерна – как идущие одна за другой ступеньки на приставной лестнице. Следовательно, ее резкое плавление, наблюдаемое в лаборатории, вроде бы противоречит ожиданиям. Однако, когда нити расцепляются, высвобожденная одноцепочечная ДНК изгибается и скручивается в трех измерениях (см. рисунок) под действием случайных сил, влияющих на все молекулы, которые мы обсудим в этой книге. Хотя движения нитей случайны, их последствия стабильны и предсказуемы (с подобным мы не раз еще столкнемся): благодаря конечной конфигурационной свободе полное их разделение происходит при фиксированной температуре перехода, как это свойственно трехмерным материалам. Располагая экспериментальными данными и теоретическим обоснованием, мы можем даже спрогнозировать температуру, при которой разделится та или иная молекула ДНК. Обычно температура перехода составляет около 95 °C, что чуть ниже температуры кипения воды, но точное значение сильно зависит от нуклеотидной последовательности.
Итак, мы можем разделить нити ДНК в пробирке, просто нагрев ее. Если мы хотим реплицировать эту ДНК, далее необходимо построить комплементарные последовательности к каждой из нитей. Для этого мы можем позаимствовать у природы инструмент, рутинно применяемый нашими клетками, – фермент ДНК-полимеразу. Однако при температуре плавления ДНК обычные белки превратятся в бесполезную резиноподобную массу наподобие вареного яичного белка (который в сухом остатке и состоит главным образом из белка). Биологам пришлось найти хитрый способ этого избежать: мы применяем ДНК-полимеразы из бактерий, живущих в горячих источниках, поскольку белки этих организмов в ходе эволюции приспособились исправно работать при высокой температуре. При этом важно, что для начала репликации нити ДНК любой полимеразе необходим хотя бы небольшой двухнитевой участок молекулы (см. рисунок ниже). Бактериологи обнаружили и очистили термостабильную полимеразу в 1976 году, и к началу 1980-х все ингредиенты оказались в сборе. В 1983 году рецепт, в котором сочетаются нуклеотиды, полимеразы, молекулы ДНК и температура, пришел в голову ученому Кэри Муллису, когда он ночью ехал вдоль Берегового хребта Калифорнии5. Вместе с рецептом пришло и осознание, что так открывается дорога к простой и почти безграничной репликации ДНК. Сегодня этот процесс называется полимеразной цепной реакцией, или ПЦР[9].
Чтобы провести ПЦР, первым делом мы вносим в деионизованную воду со специальным солевым раствором (буфером) все ингредиенты: небольшое количество ДНК, которую мы хотим реплицировать[10]; ДНК-полимеразу; отдельные нуклеотиды (A, Ц, Г и T) в большом количестве и праймеры – в достаточном. Праймеры, или затравки, представляют собой короткие одноцепочечные фрагменты ДНК (обычно не длиннее 30 нуклеотидов), комплементарные концам копируемого участка ДНК. Мелкие детальки, разбросанные по рисункам, – это праймеры (они подлиннее) и нуклеотиды (они покороче).
Далее мы повышаем температуру примерно до 95 °C, чтобы расплавить ДНК и из исходной двойной спирали получить две отдельные нити.
После этого мы понижаем температуру, чтобы праймеры связались с соответствующими концами однонитевых ДНК. Праймеров много, поэтому матричная однонитевая ДНК с гораздо большей вероятностью наткнется на праймер, чем на свою бывшую партнерскую нить: предсказуемая случайность работает на нас. Далее полимераза «садится» на ДНК-матрицу и наращивает конец праймера подходящими нуклеотидами, звено за звеном синтезируя комплементарную нить. После завершения процесса мы получаем две двойных спирали ДНК, созданные по шаблону одной исходной.
Затем мы повторяем цикл нагревания, охлаждения и синтеза, что дает нам уже 4 молекулы ДНК; в последующих циклах мы получим 8, 16, 32, 64… Соответственно, 10 удвоений даст нам 1024 молекулы, 20 – миллион, 30 (что вполне позволяют автоматизированные приборы для ПЦР – амплификаторы, или термоциклеры) – более миллиарда![11]
Следовательно, ничтожное количество ДНК мы можем превращать во множество идентичных молекул, тем самым как бы усиливая шепот до громкого хора реплик, который можно на любой вкус применять в медицинской диагностике, терапии и криминалистике. В живых организмах копирование ДНК происходит только в качестве элемента замысловатого репродуктивного танца, порождающего совершенно новую клетку или даже организм. Полимеразная цепная реакция позволяет копировать ДНК по нашему желанию. Рецепт ее прекрасен в своей простоте. Сам Муллис писал, что, узнав о его изобретении, молекулярные биологи «чуть ли не всегда первым делом произносили: `И почему же я до этого не додумался?'«Муллис отвечал на это так: «И никто на самом деле не знает почему; я уж точно не знаю. Однажды ночью эта мысль просто врезалась мне в голову».
11
Очевидно, что синтезированные копии ДНК тоже служат матрицами для построения новых молекул, однако амплификация в одной смеси не может длиться вечно: запас рабочей полимеразы, например, истощается примерно к 30-му циклу, и если необходимо, эту же ПЦР-смесь сильно разбавляют, внося новые ингредиенты, кроме исходной ДНК.