Молодежь роптала на гетмана, мечтая, объединившись с Карлом, «грянуть <…> войною/На ненавистную Москву!». Но никто не ведал тайных планов коварного и мстительного Мазепы. Давно он вынашивает план измены, никому не открывая его, но тайные его помыслы постиг оскорбленный Кочубей и задумал отомстить за оскорбление дома, открыв Петру планы изменника. Когда-то Кочубей с Мазепой были друзьями и поверяли друг другу свои чувства, тогда приоткрывал свои замыслы Мазепа, но теперь между ними обида, которую простить не может Кочубей. Дух мести поддерживает в нем и жена. Теперь нужен только надежный человек, готовый, не робея, положить к ногам Петра донос Кочубея на гетмана.
Такой человек нашелся среди полтавских казаков, когда-то отвергнутый Марией, но по-прежнему любящий ее даже в ее позоре и ненавидящий ее соблазнителя. Он отправляется в путь с зашитым в шапке доносом Кочубея на изменника-гетмана. Мазепа же, не подозревающий о страшной опасности, плетет политическую интригу, ведя переговоры с посланником иезуитов, возмущая казаков на Дону, поднимая против Москвы Крым, Польшу и Турцию. И вот посреди этих коварных забот русские вельможи переслали ему донос на него, писанный в Полтаве и оставленный Петром без внимания. Оправдываясь перед Петром и убеждая его в своей верности, Мазепа требует казни доносчиков, казни отца своей возлюбленной, «…но дочери любовь главы отцовской не искупит». Мария же самозабвенно любит Мазепу и презирает молву. Лишь иногда ею овладевает печаль при мысли о родителях. Но она не знает еще того, что знает уже вся Украина, страшная тайна от нее скрыта.
Мазепа мрачен, и «ум его/Смущен жестокими мечтами». Даже ласки Марии не в состоянии развеять его страшные мысли, он остается холоден к ним. Оскорбленная Мария укоряет его, говоря, что ради него сгубила собственное счастье, опозорила себя. Мазепа пытается успокоить Марию словами любви, но она обвиняет его в хитрости и притворстве. Она даже ревнует его к некой Дульской. Мария хочет знать причину Мазепиной холодности. И Мазепа открывает ей свои замыслы восстания Украины против владычества Москвы. Мария в восторге и жаждет видеть возлюбленного с царским венцом на голове. Она сохранит ему верность и в несчастье и даже пойдет с ним на плаху. И Мазепа подвергает Марию страшному испытанию: он спрашивает, кто ей дороже — отец или супруг? Он старается принудить ее к однозначному ответу, ставит ее перед ужасным выбором: чью гибель она предпочтет, если ей будет суждено выбирать, кого отправить на казнь. И желанный ответ получен.
«Тиха украинская ночь». В старом замке в Белой Церкви сидит в башне окованный Кочубей и ждет казни, которой не боится — его гнетет позор, потеря чести. Он отдан царем на поругание врагу, не имея возможности никому завещать свою месть обидчику. Открывается дверь его темницы, и входит кровожадный Орлик. Мазепе известно, что Кочубей спрятал сокровища, и Орлик пришел узнать, где они таятся. Кочубей отвечает, что его сокровищами были его честь, честь дочери, но эти сокровища отняты пыткой и Мазепой, а третий клад — святую месть — он готовится снести Богу, Орлик допытывается, где спрятаны деньги, но безуспешно, и Кочубея отдают в руки палачу.
Мария, ласкаемая Мазепой, еще не знает об ужасной судьбе отца, и Мазепа содрогается от мысли, что будет с ней, когда все откроется. Он раскаивается, что прельстил ее, что попытался впрячь в одну телегу «коня и трепетную лань». Оставя сидящую в неведенье Марию, мучимый сомнениями, Мазепа выходит из дворца.
На рассвете в покой, где спала Мария, прокралась ее мать и открыла дочери страшную весть. Мать не может поверить, что дочери ничего не известно, она просит Марию пасть к ногам Мазепы и умолить его пощадить отца. Не в силах перенести душевные муки, Мария лишается чувств.
На месте казни собралась огромная толпа. На телеге привезли осужденных Кочубея и Искру. Мученики всходят на плаху, палач рубит им головы и, держа за чубы, показывает толпе. Когда место казни уже опустело, прибегают две женщины, но, увы, они опоздали.
Вернувшись домой после ужасной казни, Мазепа находит светлицу Марии пустой. Он отправляет казаков на поиски, но все тщетно: никто нигде не видал Марию.
Душевная печаль не мешает гетману осуществлять свои политические замыслы. Продолжая сношения со шведским королем, Мазепа притворяется смертельно больным, но проворно встает со смертного одра, когда Карл переносит военные действия на Украину. Теперь Мазепа ведет полки против Петра. Петр сам ведет дружины к Полтаве, и вот две армии стали друг против друга, готовые к утреннему сражению. Ночью перед сражением Мазепа беседует с Орликом и говорит о своем разочаровании в Карле, который не кажется ему государственным мужем, могущим тягаться с самодержавным великаном. Орлик отвечает, что еще не поздно перейти на сторону Петра, но Мазепа отвергает это предложение и открывает причину своей ненависти к русскому царю. Когда-то на пиру в ответ на смело сказанное слово Петр схватил Мазепу за усы. За это оскорбление и поклялся отомстить Петру Мазепа.