Турецкая эскадра из 16 вымпелов располагала 1210 орудиями. На русской эскадре было всего 728 пушек.
Предвидя решающий характер схватки с неприятелем, Сенявин накануне сражения, перед уходом с Тенедоса, отдал свой знаменитый приказ:
«Обстоятельства обязывают нас дать решительное сражение, покуда флагманы неприятельские не будут разбиты сильно, до тех пор ожидать должно сражения весьма упорного, посему сделать нападение следующим образом: по числу неприятельских адмиралов, чтобы каждого атаковать двумя нашими, назначаются „Рафаил“ с „Сильным“, „Селафаил“ с „Уриилом“ и „Мощный“ с „Ярославом“. По сигналу № 3 немедленно спускаться сим кораблям на флагманов неприятельских и атаковать их со всевозможною решительностью, как можно ближе, отнюдь не боясь, что неприятель пожелает зажечь себя.
Прошедшее сражение 10 мая показало, что чем ближе к нему, тем от него меньше вреда, следовательно, если бы кому случилось свалиться на абордаж, то и тогда можно ожидать вящего успеха. Пришед на картечный выстрел, начинать стрелять. Её ли неприятель под парусами, бить по мачтам, ежели же на якоре, бить по корпусу. Нападать двум с одной стороны, но не с обоих бортов; если случится дать место другому кораблю, то ни в каком случае не отходить далее картечного выстрела. С кем начато сражение, с тем и кончать или потоплением или покорением неприятельского корабля. Как по множеству непредвиденных случайностей невозможно сделать положительных наставлений на каждый я не распространяю их более; надеюсь, что каждый сын отечества почтится выполнить долг свой славным образом».
Сенявин, конечно, не был знаком с известным планом Нельсона перед Трафальгаром, но по своему направлению главного удара, нацеленности командиров на победу, без скованности их инициативы, ставя конкретные задачи каждому кораблю, приказ Сенявина ни в чём не уступал документу Нельсона. Боевой настрой флагмана передался командирам и всем экипажам.
Оставив для защиты Тенедоса несколько судов, Сенявин погнался за неприятелем, которого настиг утром 19 июня около Лемноса. Капудан-паша тотчас же отошёл к Афону, где построился в боевую линию. Турки первыми открыли огонь на большом расстоянии, но русские не отвечали, пока не сблизились на картечный выстрел. Началось Афонское сражение.
Сенявин во время сражения подвергался величайшей опасности: сигнальщику, подававшему ему рупору, оторвало руку, минуту спустя ядро разорвало его пополам; вслед за этим рядом с адмиралом убило ещё двух матросов. Сенявин остался невредим. Спокойно отдавая приказания, он вдохновлял своим примером подчинённых. К полудню турецкие флагманы были сбиты, остальные суда, сильно повреждённые, потеряли строй. Турки дрогнули и, пользуясь попутным ветром, стали отступать. Преследование разбитого противника прекратилось, но ночью корабль «Селафаил» нагнал и взял в плен корабль флагмана Бекир-Бея. Преследуемые линкор и два фрегата турки, ввиду безысходности, взорвали сами. Общее число потерь противника достигло почти 1000 человек убитыми и ранеными, а пленными 774 человека. Саид-Али потерял три корабля и пять фрегатов, при этом у Сенявина не было выведено из строя ни одного корабля. У русских потери составили 81 убитых и 170 раненых.
Убедившись, что остатки эскадры турок укрываются в Дарданеллах, Сенявин с эскадрой поспешил на помощь осаждённым в крепости Тенедос. Эскадра блокировала 30 тысячный турецкий десант, который капитулировал. С этого времени эскадра Сенявина стали полновластным хозяином в Эгейском море и Архипе лаге. Афонское сражение ещё полнее раскрыло флотоводческий талант Сенявина. Наградой адмиралу за победу в этом сражении был орден Святого Александра Невского.
Однако радость одержанной победы вскоре омрачилась слухами о заключении с Францией в 1807 году Тильзитского мира и о вероятном прекращении военных действий против французов и турок.
Сенявин долго не хотел верить этим слухам, пока не получил 23 августа 1807 года рескрипт Александра I. В рескрипте Сенявину повелевалось не только прекратить военные действия, но и немедленно вернуть Ионические и Далматинские острова и Боко-де Которо — Франции, а Тенедос — Турции и как можно скорее возвращаться со всей эскадрой в Россию. Более того, он должен возвратить туркам все взятые у них суда и призы. Последнее было выше сил Дмитрия Николаевича, и он пренебрёг им, не находя возможным отдавать боевые трофеи. Сколько русских матросов полегло в сражениях за эти корабли и суда! Сенявин месяцами не получал из Петербурга положенное жалованье экипажам и деньги, чтобы кормить и содержать людей. Тогда шли в ход средства, полученные от продажи захваченных судов.