Обиды и притеснения, которые отовсюду сыпались на православных, разумеется, не могли не волновать преподобного. В сильном возбуждении он становится на молитву перед Купятицкой иконой Богоматери и опять явственно слышит голос, исходящий от святой иконы: «Афанасий! Проси еще с помощью Моего образа на будущем сейме перед королем польским и Польским государством о полном уничтожении проклятой унии. Хорошо будет, если послушают и уничтожат ее: поживут еще счастливо в будущих летах».
Устрашенный видением, св. Афанасий пять дней был чрезвычайно слаб, не пил, не ел и все раздумывал о том, как ему поступить. Он знал, что смелые речи на сейме снова вызовут суд над ним и осуждение, и в то же время боялся нарушить волю Божию. Смущался великостью дела, которое на него, смиренного, возлагал Господь, и успокаивал себя тем, что даже ослица Валаама говорила некогда по воле Божией. Подобно другим инокам хотел бы преподобный сидеть в обители, молясь Творцу своему за себя и за всех властей, духовных и светских, а особливо за своих благодетелей, но, вынуждаемый волей Божией, он начал готовиться к генеральному сейму 1645 г. Прп. Афанасий имел намерение, как в предшествующий сейм, поднести корою и сановникам в нескольких тетрадях снимок Купятицкой иконы Пресвятой Богородицы вместе с описанием чудес от нее во время путешествия в Москву, а затем сделать предложение об отмене унии и успокоении православной веры. Но преподобному не суждено было осуществить свои намерения: в ноябре 1644 г. он был арестован в Бресте, отвезен в Варшаву и брошен в оковы, в которых содержался более года.
И в тюрьме, как на свободе, преподобный более всего отдавался скорби о тяжелом положении Православной Церкви в Польско–Литовском государстве и мысли о «полном и общем успокоении» истинной веры. Лучшим выражением его тогдашнего настроения служит стихотворение, которое он составил, сидя в тюрьме, и, положив на голос, распевал для утоления душевной боли: «Пошли покой Церкви Своей, Христе Боже! Не знаю, может ли кто из нас терпеть дальше! Дай нам помощь в печали, чтобы мы всецело отдались вере святой, непорочной».
Когда надзор за преподобным был ослаблен, он, сидя в тюрьме, усердно занялся составлением памятной записки (мемориала), которая и подана была от его имени королю Владиславу 29 июня 1645 г. во время заседания генерального сейма. В записке своей преподобный доказывает: Русь с самого принятия христианства стояла в церковной зависимости от Константинопольского патриарха, а униаты, «отбегшие пастыря своего законного» и отдавшиеся другому, не настоящему (папе), подлежат анафеме, как отступники от веры; самая уния принята была духовными по корыстным побуждениям: например, епископ Игнатий Поцей, один из ее защитников, добивался сенаторского кресла; митрополит Рагоза и епископ Кирилл Терлецкий склонялись к унии, привлекаемые вольностями, которые им обещаны от лица папы. «От того часу, — говорит св. Афанасий, — как Каин Авеля и Измаил Исаака, так проклятый униат бил и преследовал православного брата своего и по сие время, с помощью прислужников и врагов правды святой, при попущении Божием, как хочет, так и злодействует: бедных людей всякого сословия, как в братствах церковных, так и во всяких советах, судебных и ремесленных, клевеща безбожно, грабит и дерет со всего, что имеют православные христиане — с веры святой, с совести чистой, с славы доброй, с имущества, всячески поносит их и бьет; кроме того — и это хуже всего — печатает, отбирает, повергает в нищенство и уничтожает церкви, мешает свободе благочестивой совести. Во многих и разных местах в королевстве христианском ради той проклятой унии и по сие время совершаются ненужные кровопролития. В конце концов и с казаками из–за той же унии была внутренняя бесполезная война; из–за нее милость исчезла чуть не во всех; из–за нее ласкательство, подхалимство, зависть, предательства, злодейства и — хуже всего — размножается проклятая вражда; из–за нее погиб порядок духовный и светский». Св. Афанасий обращается к королю с мольбою отменить унию, введенную королевской властью: духовные отцы (епископы) уже не могут улучшить положения, так как сами нуждаются в исправлении. При вступлении на престол король присягою скрепил обещание умирить Православную Церковь, а между тем этого не сделано и доселе. Не нужно насилия ни над чьей совестью: пусть униаты остаются, если хотят, при своих заблуждениях, но и пусть православные будут свободны в своей вере.