В первых числах июня 1941 года батальон отбыл в Южную Буковину, где еще около месяца проходил интенсивное обучение, по завершении которого походным маршем двинулся в район Ясс, а оттуда через Кишинев и Дубоссары — на Одессу.
В апреле 1941 года ОУН (Б) направила в учебный центр около 400 добровольцев, из которых и была сформирована «Специальная группа «Нахтигаль». (В послевоенных оуновских источниках — Северный куринь ДУН). Она была создана на основании договора между Веховным командованием немецкого вермахта (ОКВ) и руководством ОУН (Б), благодаря поддержке руководителя военной разведки абвер адмирала Канариса.
Набор добровольцев проводило Бюро ОУН в Кракове под руководством сотника Романа Шухевича. Местная организационная сетка отсылала кандидатов в Краков, где они проходили медосмотр, а потом уже отправлялись в учебные лагеря.
Основной учебный лагерь размещался в городе Нойгаммере (Силезия), в расположении полка «Бранденбург — 800». В Нойгаммере курсантов переодели в униформу, разделили на группы и подгруппы. Начался курс полноценной боевой подготовки под руководством инструкторов абвера. Продолжался он с начала мая до 17 июня 1941 года.
Поскольку батальон «Нахтигаль» сам по себе не был крупной оперативной единицей, его прикрепили к 1-му батальонному полку «Бранденбург-800».
18 июня 1941 года батальон перебросили в приграничные с СССР районы. В 03.15 утра 22 июня 1941 года 1-й Бранденбургский батальон получил задание наступать на Перемышль и перешел реку Сан. Он должен был атаковать оборонные рубежи Львова с северной стороны, а «Нахтигаль» шел в передовой линии как его резерв.
В полночь с 29 на 30 июня 1941 года командир «Бранденбурга» приказал захватить Львов. Обе части вошли в него в 04.30, не встретив сопротивления подразделений Красной Армии. Еще накануне ночью последние части РККА покинули город.
Сотни «Нахтигаля» заняли некоторые стратегические и промышленные объекты, например, ратушу и радиостанцию. При вступлении в город батальон разделили: часть первой сотни пошла охранять собор Св. Юра, часть — на улицы Лонского и Пелчинскую, вторая и третья сотни пошли на Замарстинов, где заняли тюрьму. Около 10.30 отряд из собора Св. Юра занял дом городской управы на площади «Рынок». Часть 1-й сотни охраняла тюрьму НКВД на Лонского и была заменена отрядом немецкой полиции на следующий день, 1 июля в 10.00.
Сотник батальона Роман Шухевич, сразу после взятия города, 30 июня 1941 года, принял участие в ассамблее украинских представителей, которая провозгласила Акт независимости Украины. После этого украинские офицеры батальона были сняты с командных постов, а батальон перевели в непосредственное подчинение немецким командирам.
Отдельные военнослужащие батальона совместно с националистами из подполья ОУН и оперативно сформированными немцами подразделениями вспомогательной полиции приняли активное участие в карательных акциях во Львове и ряде других городов, в ходе которых погибло несколько тысяч человек, преимущественно из числа еврейской и польской интеллигенции.
Из состава батальона были выделены небольшие группы, в задачу которых входила ликвидация людей, занесенных в составленные в соответствии с инструкцией ОУН от мая 1941 года «черные списки». Информация об этом содержится в послевоенных показаниях военнослужащего «Нахтигаля» Григория Мельника:
«В городе Львове батальон размещался в разных местах. Из нашего взвода и из других взводов в тот же день по приказу Оберлендера и Шухевича была отобрана группа легионеров общей численностью около восьмидесяти человек. Среди них были Лущик Григорий, Панькив Иван, Панчак Василий и другие.
Через 4–5 дней эти люди возвратились и рассказывали, что они арестовали и расстреляли много жителей города.
Панькив и Лущик говорили, что они вместе с участниками ранее заброшенных диверсионных групп получили от Оберлендера и Шухевича списки подлежащих аресту людей. Арестованных свозили в определенные места, среди которых я запомнил названную ими бурсу Абрагамовича, а затем по приказу Оберлендера и Шухевича арестованных расстреляли. Мне Лущик и Панчак говорили, что они лично расстреляли на Вулецкой горе польских ученых, и назвали их фамилии, среди которых мне хорошо запомнилась фамилия профессора Бартеля, известного мне как бывшего министра панской Польши».