В 1780 году Прохор тяжко заболел, и все тело его распухло. Ни один врач не мог определить вида его болезни, но предполагали, что это сделалась водяная болезнь. Недуг длился в продолжение трех лет, из которых не менее половины Прохор провел в постели. Строитель о. Пахомий и старец о. Исаия попеременно ходили за ним и почти неотлучно находились при нем. Тут-то и открылось, как все, и прежде других начальники, уважали, любили и жалели Прохора, бывшего тогда еще простым послушником. Наконец стали опасаться за жизнь больного, и о. Пахомий настоятельно предлагал пригласить врача или, по крайней мере, открыть кровь. Тогда смиренный Прохор позволил себе сказать игумену: «Я предал себя, отче святый, Истинному Врачу душ и телес, Господу нашему Иисусу Христу и Пречистой Его Матери; если же любовь ваша рассудит, снабдите меня, убогого, Господа ради, небесным врачевством — причастием Св. Таин». Старец Иосиф, по просьбе Прохора и собственному усердию, особо отслужил о здравии больного всенощное бдение и литургию. Прохор был исповедан и причащен. В скором времени он выздоровел, что весьма удивило всех. Никто не понимал, как мог он столь скоро оправиться, и только впоследствии о. Серафим открыл тайну некоторым: после причащения Св. Таин ему явилась Пресвятая Дева Мария, в несказанном свете, с апостолами Иоанном Богословом и Петром и, обратясь к Иоанну лицем и указывая перстом на Прохора, Владычица сказала: «Этот Нашего рода!»
«Правую-то ручку, радость моя, — говорил о. Серафим церковнице Ксении, — положила мне на голову, а в левой-то ручке держала жезл; и этим-то жезлом, радость моя, и коснулась убогого Серафима; у меня на том месте, на правом бедре-то, и сделалось углубление, матушка; вода-то вся в него и вытекла, и спасла Царица Небесная убогого Серафима; а рана пребольшая была, и до сих пор яма-то цела, матушка, погляди-ка, дай ручку!» — «И батюшка, бывало, сам возьмет, да и вложит мою руку в яму, — прибавляла матушка Ксения, — и велика же она была у него, так вот весь кулак и взойдет!» Много душевной пользы принесла Прохору эта болезнь: дух его окреп в вере, любви и надежде на Бога.
В период послушничества Прохора, при настоятеле о. Пахомии, предприняты были в Саровской пустыне многие нужные постройки. В числе их на месте келии, в которой болел Прохор, строилась больница для лечения недужных и успокоения престарелых, и при больнице церковь о двух этажах с престолами: в нижнем во имя свв. Зосимы и Савватия, чудотворцев Соловецких, в верхнем — во славу Преображения Спасителя. Прохор после болезни, молодой еще послушник, был посылаем за сбором денег в разные места на сооружение церкви. Благодарный за свое исцеление и попечение начальства, он с охотою понес трудный подвиг сборщика. Странствуя по ближайшим к Сарову городам, Прохор был и в Курске, на месте своей родины, но не застал уже матери своей в живых. Брат Алексей, со своей стороны, оказал Прохору немалую помощь для построения церкви. Вернувшись домой, Прохор, как искусный столяр, построил собственными руками престол из кипарисного дерева для нижней больничной церкви в честь преподобных Зосимы и Савватия.
В течение восьми лет юный Прохор был послушником. Наружный вид его к этому времени изменился: будучи высокого роста, около 2 арш. и 8-ми вершков, несмотря на строгое воздержание и подвиги, он имел полное, покрытое приятною белизною, лицо, прямой и острый нос, светло-голубые глаза, весьма выразительные и проницательные; густые брови и светло-русые волосы на голове. Лицо его окаймлялось густою, окладистою бородою, с которою на оконечностях рта соединялись длинные и густые усы. Он имел мужественное сложение, обладал большими физическими силами, увлекательным даром слова и счастливой памятью. Теперь он прошел уже все степени монастырского искуса и был способен и готов принять монашеские обеты.
13-го августа 1786 года, с соизволения Св. Синода, о. Пахомий постриг послушника Прохора в сан инока. Восприемными отцами его при пострижении были о. Иосиф и о. Исаия. При посвящении ему было дано имя Серафим (пламенный). 27-го октября 1786 года монах Серафим, по ходатайству о. Пахомия, был посвящен преосвященным Виктором, епископом Владимирским и Муромским, в сан иеродиакона. Он вполне предался новому своему, поистине уже ангельскому, служению. Со дня возведения в сан иеродиакона он, храня чистоту души и тела, в течение пяти лет и девяти месяцев, почти беспрерывно находился в служении. Все ночи на воскресные и праздничные дни проводил в бодрствовании и молитве, неподвижно стоя до самой литургии. По окончании же каждой Божественной службы, оставаясь еще надолго в храме, он, по обязанности священнодиакона, приводил в порядок утварь и заботился о чистоте Алтаря Господня. Господь, видя ревность и усердие к подвигам, даровал о. Серафиму силу и крепость, так что он не чувствовал утомления, не нуждался в отдыхе, часто забывал о пище и питье и, ложась спать, жалел, что человек не может служить Богу беспрерывно, подобно Ангелам.