В 1793 году о. Серафиму исполнилось 34 года, и начальство, видя, что он по своим подвигам стал выше других братий и заслуживает преимущество пред многими, ходатайствовало о возведении его в сан иеромонаха. Так как в этом же году Саровская обитель, по новому расписанию, перешла из Владимирской епархии в Тамбовскую, то о. Серафима вызвали в Тамбов, и 2-го сентября епископ Феофил рукоположил его во иеромонаха. С получением высшей благодати священства о. Серафим стал подвизаться в духовной жизни с вящею ревностью и удвоенною любовью. В течении долгого времени он продолжал непрерывное служение, ежедневно приобщаясь с горячею любовью, верою и благоговением.
Сделавшись иеромонахом, о. Серафим возымел намерение совсем поселиться в пустыне, так как пустынническая жизнь была его призванием и назначением свыше. К тому же, от непрестанного келейного бдения, от постоянного стояния в церкви на ногах с небольшим отдыхом во время ночи, о. Серафим впал в недуг: у него распухли ноги, и на них открылись раны, так что некоторое время он лишился возможности священнодействовать. Болезнь эта была немалым побуждением к избранию пустыннической жизни, хотя для отдыха следовало ему просить у настоятеля о. Пахомия благословения удалиться в больничные келии, а не в пустыню, т. е. от меньших трудов — к большим и тягчайшим. Великий старец Пахомий благословил его. Это было последнее благословение, полученное о. Серафимом от мудрого, добродетельного и почтенного старца, в виду болезни его и приближения смерти. О. Серафим, хорошо помня, как во время его болезни ходил за ним о. Пахомий, теперь сам служил ему с самоотвержением. Раз о. Серафим заметил, что к болезни о. Пахомия присоединилась еще какая-то душевная забота и печаль.
— О чем, отче святый, так печалишься ты? — спросил его о. Серафим.
— Я скорблю о сестрах Дивеевской общины, — ответил старец Пахомий, — кто их будет назирать после меня?
О. Серафим, желая успокоить старца в предсмертные минуты, обещался сам назирать их и поддерживать все так же после смерти его, как было при нем. Это обещание успокоило и обрадовало отходящего ко Господу о. Пахомия. Он поцеловал о. Серафима и затем вскоре опочил мирным сном праведника. О. Серафим горько оплакал потерю старца Пахомия и, с благословения нового настоятеля о. Исаии, также горячо любимого, удалился в пустынную келию (20-го ноября 1794-го года, в день прихода в Саровскую пустынь).
Несмотря на удаление о. Серафима в пустынку, народ стал беспокоить его там. Приходили и женщины.
Великий подвижник, начиная строгую пустынническую жизнь, считал для себя неудобным посещение женского пола, так как это могло соблазнить и монашествующих, и мирян, склонных к осуждению. Но, с другой стороны, лишить женщин назидания, ради которого они приходили к пустыннику, могло быть делом, неугодным Богу. Он стал просить Господа и Пресвятую Богородицу об исполнении его желания, и чтобы Всевышний, если это не противно Его воле, дал ему знамение на то преклонением ветвей вблизи стоявших дерев. В преданиях, записанных в свое время, есть сказание, что Господь Бог действительно дал ему знамение Своего изволения. Наступил праздник Рождества Христова; о. Серафим пришел в монастырь к поздней обедне в храм Живоносного Источника и причастился Св. Христовых Таин. После обеда в своей монастырской келии он вернулся на ночь в пустыню. На следующий день, 26-го декабря, празднуемый по положению (Собор Пресвятой Богородицы), о. Серафим вернулся ночью в обитель. Проходя свой холм, где он опускается вниз долу, отчего гора и названа была о. Серафимом Афонскою, он увидел, что с обеих сторон тропинки огромные сучья вековых сосен склонились и завалили дорожку; вечером ничего этого не было. О. Серафим упал на колени и поблагодарил Бога за данное, по молитве его, знамение. Теперь он знал, что Господу Богу угодно, дабы жены не входили на его гору.
В продолжение всего подвижничества о. Серафим носил постоянно одну и ту же убогую одежду: белый полотняной балахон, кожаные рукавицы, кожаные бахилы — вроде чулок, поверх которых надевали лапти, и поношенную камилавку. На балахоне висел крест, тот самый, которым благословила его родная мать, отпуская из дома; а за плечами висела сумка, в которой он носил при себе св. Евангелие. Ношение креста и Евангелия имело, конечно, глубокий смысл. По подражанию древним святым, о. Серафим носил вериги на обоих плечах, и к ним были привешены кресты: одни спереди в 20 ф., другие сзади в 8 ф. каждый, и еще железный пояс. И эту тяжесть старец носил во все время своего пустынножительства. В морозы он накладывал на грудь чулок или тряпку, а в баню никогда не ходил. Видимые его подвиги состояли из молитвословий, чтения книг, телесных трудов, соблюдения правил великого Пахомия и т. д. В холодную пору он топил келию, колол и рубил дрова, но иногда добровольно переносил холод и мороз. Летом он возделывал гряды на своем огороде и удабривал землю, собирал мох с болот. Во время подобной работы он ходил иногда без одежды, перепоясав лишь чресла свои, и насекомые жестоко уязвляли тело его, отчего оно опухало, синело по местам и запекалось кровью. Старец добровольно терпел эти язвы Господа ради, руководствуясь примерами подвижников древнего времени. На грядах, удобренных мхом, о. Серафим сажал семенами лук и другие овощи, которыми он питался летом. Телесный труд порождал в нем благодушное состояние, и о. Серафим работал с пением молитв, тропарей и канонов.