После этого явления отец Серафим еще больше стал уединенно молиться, все чаще он уходил по вечерам в свою лесную келию и проводил там в молитве целую ночь, и лишь к утру возвращался в Саров.
В почин сентября 1793 года иеродиакона Серафима епархиальное начальство вызвало в Тамбов и там рукоположило во иеромонаха. С этого времени, пока батюшка жил в самой Пустыни, он ежедневно приобщался Святых Таин. Облеченный благодатию священства, благоговейно и с любовью проходит он служение Святой Церкви. Подобно Серафиму небесному, он всецело предает себя на служение Богу, молитвенно бодрствуя пред Ним день и ночь; забывает о пище и питье, и сожалеет, что нуждается в отдыхе и не может беспрерывно служить Богу. Задачу его жизни, по его собственному выражению, составляет теперь «окончательное устройство дома души». Отныне он «носит в своей груда сердце, как воск, таявшее от неизреченной сладости посещавших его небесных видений».
В это время отец Серафим был уже достаточно подготовлен к трудному и великому подвигу — пустынножительству. Вскоре скончался настоятель монастыря, архимандрит Пахомий, перед смертью благословил он отца Серафима на подвиги в уединенной пустыни. 20 ноября 1794 года, тридцати пяти лет от роду, иеромонах Серафим удалился в пустынную келию, расположенную в 5-6 верстах от монастыря, в дремучем лесу, вблизи речки Саровки. Поводом к переселению послужил тяжкий недуг: от долгого стояния в храме и на домашней молитве у него начали опухать ноги и открылись раны. Лесная келия была простой избой с печью, сенями и крылечком. Вокруг келии разбит небольшой огород, который по весне и летом, возделывал отец Серафим; был у него и пчельник. Одежда батюшки была самая простая и грубая: на голове поношенная камилавка, на плечах белый полотняный подрясник, руки в кожаных рукавицах, ноги в бахилах (кожаных чулках) и лаптях. На груди открыто висел медный крест — матушкино благословение, за спиною сумка, а в ней Евангелие.
Одна и та же одежда была у него летом и зимою. В труде обретал светлое и радостное настроение. Случалось, что во время работы лопата или мотыка вдруг выпадала из его рук, при этом лицо его принимало дивное выражение, и он, стоя неподвижно, углублялся в созерцание тайн Божиих. Взрыхляя землю, отец Серафим распевал псалмы и церковные песнопения. Особенно любил петь догматик первого гласа: «Всемирную славу...» и антифон: «Пустынным непрестанное Божественное желание бывает...» Молитвенное же правило его в Пустыни бывало обширно и строго. Вместо вечерних молитв подряд клал тысячу поклонов. Ел отец Серафим одни только овощи. Сухой, черствый хлеб он брал с собою из монастыря по воскресеньям на всю седмицу, но раздавал его почти весь птицам и лесным зверям, которые подходили к нему и любили его общения. Было время, когда пустынник отказывался даже и от хлеба. В продолжение почти трех лет питался лесной травкой — снытью: варил ее в горшочке, а на зиму сушил про запас. В воскресные же и праздничные дни, а также в кануны их, отец Серафим приходил в обитель, выстаивал все положенные богослужения и приобщался Святых Христовых Таин. Уветлив был, беседуя с иноками, внимавшими его мудрым наставлениям. И, побеседовав, снова удалялся в спасительную пустыню. Там пламенеющий любовию к Богу иеромонах Серафим проходил все виды самоотвержения и все подвиги молитвенного труда.
— Уединение, молитва, всепрощение и воздержание — суть четырехсоставная колесница, возносящая дух на небо, — говорил батюшка неоднократно и прежде, но теперь он всецело следовал этому своему слову.
В годы отшельничества отец Серафим всячески избегал посетителей. Встречавшим же его в лесу людям он обычно смиренно кланялся и поспешно отходил в сторону. На человека, видевшего впервые пустынножителя, эти встречи производили глубокое и неотразимое впечатление; уже один вид угодника Божия, в его убогой одежде, трогал душу, свидетельствуя о чем-то возвышенном и духовном. Этот его вид внушал благоговение не только людям, но и диким зверям. Какая дивная и трогательная картина: подвижник Серафим кормит из рук своих лесного медведя, который послушно выполняет его волю! Вглядитесь пристально в лицо батюшки, сияющее ангельским светом радости и милосердия, и вы сумеете прочесть тайну смирения и послушания медведя.
Но такая напряженная жизнь подвижника возбуждала и жестокую злобу диавола, наводящего на него разные искушения. Однажды во время молитвы отец Серафим услышал вой зверей за стенами своей келии. В другой раз какая-то шумная толпа людей начала выламывать дверь; выбила дверной косяк и бросила в жилище отшельника огромный обрубок дерева, его потом с трудом могли вынести восемь человек...