Ни Б. Моссе, ни ее последователи в нашей стране Л. В. Крюгер и И. Л. Селиванов (1976), включая в процесс заражения новый фактор — ризосферные бактерии, не определили отдельно степень участия данного фактора в образовании указанных микориз. Между тем это избавило бы исследователей от необходимости проводить кропотливую работу по разработке метода получения эндогоновых грибов из лесной подстилки, так как желаемая микориза образовалась бы при действии одной ризосферной бактерии, вместе с чем отпала бы необходимость считать ее фикомицетной.
Вряд ли теоретически можно допустить, что сапрофитные грибы, обладающие набором ферментов для разрушения мертвых растительных остатков лесной подстилки, способны осуществлять в корнях растений многочисленные синтетические процессы, поскольку такая универсальность несвойственна микроорганизмам.
Для окончания затянувшейся на несколько десятилетий дискуссии о природе и происхождении грибных симбионтов растений назрела необходимость в разработке метода выделения чистых культур эндофитов с целью установления их морфологии, физиологии, происхождения и сущности взаимосвязи с растениями. Неудачные опыты многих исследователей, предпринимавших попытки решить этот вопрос, заставили нас искать новые пути получения таких культур.
Метод выделения эндофитов. Наша работа по выделению чистых культур эндофитов из корней растений была начата с выяснения надежной стерилизации поверхности корней, не нарушающей жизнедеятельности находящихся внутри них живых организмов. Было установлено, что применение 2-3‑минутной обработки тонких корешков сулемой в концентрации 1 : 1000 и последующая отмывка сулемы спиртом и многократно стерильной водой обеспечивают стерильность поверхности корня и не нарушают жизнеспособности эндофитов. Это же достигается при короткой обработке 30%‑ной перекисью водорода.
Состав питательной среды. После долгих поисков мы остановились на следующей буферной питательной среде (г на 1 л воды): глюкоза — 8; К2НРО4 — 0,3; КН2Р04— 0,9; MgS04 — 0,2; K2SО4 — 0,1; FeS04 и MnS04 — следы, аспарагин — 0,01.
Нам удалось также установить основную особенность симбионтных грибов растений — их потребность в ростовых веществах в короткий период прорастания из растительной ткани в питательную среду и, как мы увидим дальше, в процессе прорастания из семени в корень, В обоих указанных случаях без наличия гормонального воздействия извне эти грибы не прорастают (Гельцер, 1973а, б). В редких случаях при сильной микотрофности растений и, очевидно, достаточной концентрации гормональных веществ в тканях их корней, а также при небольшом разведении питательной среды эндофиты прорастают без добавления ростовых веществ. Так были получены чистые культуры эндофитов из черники (Freisleben, 1936), корней зеленых орхидей (Wolff, 1926) и из ирисов в наших опытах.
В качестве ростовых веществ могут быть использованы спиртовые вытяжки из различных гименомицетов и фитобактериомицета, который изготовляется из актиномицета (Actinomyces lavendulae), ризосферных бактерий или наших препаратов, изготовленных из эндофитов и получивших авторские свидетельства: Симбионт I (Гельцер, 1973а) и Симбионтм2 (Гельцер, Игнатьев, 1982). Во всех случаях количество добавляемых в питательную среду ростовых веществ должно быть минимальным при экспериментально установленной концентрации препарата.
За исключением указанной особенности эндофитов, нами не выявлено каких–то их особых требований к составу питательных сред. В качестве энергетических веществ эндофиты хорошо усваивают глюкозу, сахарозу и крахмал, но неспособны использовать органические кислоты (кроме янтарной), целлюлозу и лигнин.