Многовековая адаптация эндофитов к растительной клетке, постоянство морфологических признаков при выполнении ими определенных функций, в том числе и защитного характера (см. главу 5), исключают участие в этом сложном взаимодействии случайного сообщника при заражении корней в почве естественным путем или исследователем в эксперименте. Отсутствие спороносящих органов заставляет отнести эндофиты к классу несовершенных грибов (Fungi imperfecli), где они могут быть выделены в особый порядок симбиофитов — Symbiophytum, отличительной особенностью которых могут являться их морфология и физиологическая способность к синтезу определенных соединений.
Метод получения чистых культур эндофитов из корней растений дал возможность не только составить правильное представление об их морфологии, по и обнаружить наличие эндофитов в корнях тех немногих растений, у которых из–за слабого развития симбионта он не мог быть визуально обнаружен под микроскопом.
Нам предстояло использовать этот метод для решения еще одного вопроса — вопроса о наличии эндофитов в надземных частях растений, что необходимо для доказательства наследственной передачи симбионтных грибов от семени к семени.
В руководимой нами лаборатории О. И. Громыко установила, что чистые культуры эндофитов хорошо выдерживают лиофильное высушивание и длительно сохраняют свою жизнеспособность в сухом состоянии. При прорастании в питательных средах с ростовым веществом они синтезируют пигменты тех же цветов, которые были им свойственны до сушки. Как известно, мицелий плесневых грибов не выдерживает лиофилизации.
Наличие у эндофитов в корнях растений гиф с такими характерными образованиями, как везикулы, арбускулы и спорангиолы, в которых накапливаются белковые продукты их синтеза, хорошо окрашиваемые аиалин–бляу в фиолетовый цвет, а также расположение гиф вдоль коровой паренхимы не оставляют сомнений и их принадлежности к симбионтным грибам.
В мацерированных щелочью листьях и хвое различных растений обнаруживаются слаборазвитые гифы грибов, но их признаки еще не определяют принадлежности к эндофитам.
В книге, посвященной биологии микориз, Дж. Харли (1963), приводя мнение многих авторов о наличии эндофитов в надземных частях растений, подчеркивал его недостоверность, так как все авторы отмечают «ослабленное» состояние гиф в листьях. Только применяя метод выделения чистых культур эндофитов, можно решить вопрос о присутствии симбионтных грибов в надземных частях растений.
Листья и хвоя растений стерилизовались сулемой, спиртом и промывались стерильной водой, после чего их помещали в стерильные чашки Петри с небольшим количеством питательного раствора и 1-2 каплями ростового препарата Симбионт I. Одновременно стерильность листьев проверяли на твердых питательных средах. Спустя 10-15 дней эндофиты из листьев прорастали, что отчетливо просматривалось в микроскопических препаратах, а еще через несколько дней стало возможным выделение их чистых культур. Последние были получены из листьев таких сильно микотрофных растений, как вереск, мать–и–мачеха, брусника, черника, дуб, ольха, липа и др., а также из слабо микотрофных растений картофеля и пшеницы.
В первый период роста мицелий из листьев заметно отличался от мицелия из корней простотой своего строения, малой разветвленностью гиф и слабо очерченными перегородками. Только при длительном культивировании в лабораторных питательных средах с пересевами через каждые 2-3 месяца гифы становятся более разветвленными и широкими, с четко очерченными перегородками и гранулированной плазмой, с везикулярными вздутиями, характерными для эндофитов из корней. Скорость изменения строения гифов определяется степенью микотрофности растений. Для выделения эндофитов из листьев дуба, липы, ольхи, вереска, мать–и–мачехи и других сильно микотрофных растений достаточно было несколько месяцев, тогда как эндофиты из листьев слабо микотрофных растений нуждались в культивировании в течение 1-2 лет (рис. 12). Становится очевидным, что «ослабленное» состояние и «упрощенное» строение эндофитов определяются их неспособностью использовать для питания продукты фотосинтеза листа или отсутствием последних в листе. Возможно, упрощенность функций эндофитов в надземных частях растений связана с отсутствием у них везикул, арбускул и гранулированной плазмы, а основное их назначение сводится к наследственной передаче симбионтных грибов в пыльцу и семена.