Рис. 12. Строение эндофитов» выделенных из листьев стерильно выращенной ольхи (1); та же культура через 1 (2) в 2 года (3)
Достоверность результатов выделения чистых культур эндофитов из листьев была проверена в нескольких стерильных опытах, в которых применялись широкогорлые колбы, заполненные на одну треть силикагелем с питательной средой и закрытые ватной пробкой (в силикагеле лучше, чем в песчаной среде, развивается мелкая корневая система растений, благоприятная для развития эндофитов (Гельцер, 1966). Подопытными растениями были просо, ольха и облепиха, стерильность семян которых проверялась перед посевом на твердых питательных средах. При хорошем освещении растения выращивались 45—60 дней. Контрольные семена намачивались в стерильной воде, а в опытных вариантах — в растворе ростового препарата фитобактериомицина (ФБМ) разных концентраций.
После вскрытия стерильных опытов в контрольных вариантах эндофиты не были обнаружены ни в корнях, ни в надземных частях растений, а в опытных они были выделены и из листьев, и из корней, при этом гифы эндофитов имели весьма четкие везикулярные вздутия; на корнях ольхи и облепихи образовались присущие им клубеньки (рис. 13). Очевидно, нет необходимости применять к стерильным семенам заражение какими–либо грибами. Подробнее на рассмотрении этого вопроса мы остановимся в дальнейшем.
Рис. 13. Клубеньки на корнях облепихи, выращенной из семян, обработанных ФБМ
Необходимо отметить еще одну особенность эндофитов из листьев. Они при длительном культивировании в питательных средах начинают синтезировать цветные пигменты, что характерно для чистых культур эндофитов из корней (Гельцер, 1975). Так, эндофиты из листьев цветущего вереска вскоре начали синтезировать фиолетовый пигмент, из листьев липы (через год после их выделения) — желтый пигмент, характерный для ее цветов.
Несколько культур эндофитов было выделено из завязей липы, яблони, вишни и золотистой смородины. В этом случае для эксперимента нужно брать молодые, недавно образовавшиеся завязи. В отличие от мицелия из листьев растений мицелий из завязей вскоре после своего разрастания синтезирует характерный для данного растения пигмент и по своей морфологии больше соответствует мицелию из корней. Так, колонии эндофитов из завязей липы и яблони были окрашены и ярко–желтый цвет.
Наличие симбионтных грибов в молодых завязях определило необходимость изучения самого сложного органа растения — цветочной пыльцы, которую нельзя подвергнуть поверхностной стерилизации, так как при всех применяемых для этого приемах она теряет способность к прорастанию. Легкая стерилизация возможна только для пыльцевого мешка с последующими стерильными приемами сбора пыльцы. Способность эндофитов к анабиозу подтверждает возможность их существования в пыльцевой клетке без стадии визуально наблюдаемого мицелия. Основным условием, определяющим прорастание эндофитов из растительных клеток, является наличие в питательных средах или окружающих клетках гормональных веществ. При попадании пыльцы на рыльце пестика она получает гормональное воздействие, которое вызывает ее прорастание.
Пыльцевые клетки проращивались многими генетиками, но применение ими несовершенных питательных сред, состоящих из сахара и бора, но без ростовых веществ, всегда обеспечивало развитие только первой стадии их прорастания образование пыльцевой трубки и выход плазмы, содержащей спермин. Вторая стадия — прорастание симбионтных грибов в природных условиях — происходит только при попадании пыльцы на рыльце пестика, который обладает гормональным воздействием.
Для выделения эндофитов из пыльцы в лабораторных опытах мы применяли указанную выше питательную агаровую среду. После застывания этой среды в чашках Петри ее поверхность обрабатывал и янтарной кислотой для предохранения от бактериального заражения. Пыльцевые клетки наносили в нескольких местах и смачивали их гормональным препаратом Симбионт 1 и разбавлении 0,0001. В таких условиях эндофиты пыльцы прорастали.
С. Г. Навашин (1951) установил, что прорастание пыльцы начинается с роста пыльцевой трубки и выделения из нее плазмы спермия во внешнюю среду. В наших опытах этот процесс всегда предшествовал развитию грибного мицелия. В тех случаях, когда пыльцевая трубка не прорастала или содержимое пыльцы не переходило наружу, мицелий гриба не развивался. При наличии водной пленки на поверхности агара в чашках Петри выделившееся из пыльцы плазменное содержимое переносится током жидкости на некоторое расстояние от клетки, создавая впечатление независимого от нее процесса развития грибного мицелия. При подсушке поверхности агара эндофиты прорастают непосредственно около выделившейся плазмы. На рис.14 и 15 видно развитие эндофитов у пыльцы лилии и крокусов.