Первичный почвообразовательный процесс на свежих глинистых отложениях начинается с развития сильно микотрофной мать–и–мачехи (Tussilago farfara L.), к которой обычно через несколько лет присоединяется пырей (Triticum re–pens L.). Проходит длительный период накопления азота и зольных элементов в поверхностном горизонте почвы до появления в травостое ползучего клевера (Trifolium repens L.) или других бобовых, которые очень требовательны к условиям среды. Изучение динамики накопления азота в глине, взятой из глубокой шахты метро и заросшей в первые годы мать–и–мачехой, а затем пыреем, показало, что за 16 лет верхний горизонт этой глины превратился в темноцветную дерновую почву. Первоначальное содержание в глине азота 0,010%» а после указанного срока оно составило в слое 0-5 см 0,093%, в слое 6-25 см — 0,049, 30-35 см — 0,019%. Это накопление азота произошло без всякого участия бобовых в травостое и при незначительном количестве азотобактера в верхнем горизонте — 10-20% комочков обрастания на гелевых пластинках.
Предварительный опыт по выращиванию проростков мать–и–мачехи в водной культуре с питательной смесью Гельригеля три различном содержании азота показал, что лучше всего это сильно микотрофное растение растет уже при 0,1% азота в смеси, обеспечивая себя атмосферным азотом, тогда как увеличение дозы азота до нормальной для таких растений, как пшеница или рожь, является гибельным для мать–и–мачехи.
Обстоятельный вегетационный опыт, поставленный в нашей лаборатории в полулитровых сосудах с силикагелем, с несомненностью подтвердил способность к азотфиксации сильно микотрофного растения мать–и–мачехи. Опыт проведен в двукратной повторности по следующей схеме: 1 — контроль — питательная среда без азота; 2 — питательная среда + 1,4 мг азота. В каждый сосуд высаживали по 4 проростка с зачатками листьев, которые в общей сложности содержали 11,0 мг азота. Через 2 мес. в надземной части и корнях растений, освобожденных от силикагеля, было определено содержание азота (табл. 4).
Примечание. В посадочном материале содержался азот в среднем на сосуд 11,0 мг.
Наибольшая азотфиксации (29,2 мг на сосуд) наблюдалась при добавлении в «питательную среду всего 1,4 мг азота. Высокая микотрофность корней у мать–и–мачехи была установлена и в варианте без азота.
Как будет показано ниже, способность мать–и–мачехи к азотфиксации подтвердилась также в длительных опытах в лизиметрах. Именно благодаря данной способности это растение поселяется первым как на бедных аллювиальных песках, так и на глинистых материнских породах.
Чтобы доказать азотфиксирующую способность сильно микотрофных растений, следовало установить ее наличие у чистых культур эндофитов. Изучению азотфиксирующей способности выделенных чистых культур эндофитов предшествовал длительный подбор питательных сред и условий их культивирования, необходимых для выявления продуктивности этого процесса. Обильный рост мицелия эндофитов в питательных средах можно получить при добавлении к синтетической среде с сахаром вытяжек из растений, пивного сусла или кукурузного экстракта, но в этих случаях, т. е. при хорошем азотном питании, эндофиты не фиксируют азота, что характерно для всех азотфиксирующих микроорганизмов. Способность эндофитов фиксировать азот проявляется при минимальном количестве минерального азота или азота аминокислот в среде (0,1 мг/л), что определяет длительный период роста грибов (20-30 дней) для наращивания большой массы мицелия. Еще медленнее растут эндофиты в питательной среде, без азота. Понадобилось 2-3 мес. для получения хорошо развитого мицелия у мать–и–мачехи, который фиксировал за 72 дня 0,6 мг азота, а за 118 и 127 дней — 3,2 и 4,7 мг. Эндофит из ирисов за 118 и 123 дня в среде без азота фиксировал 2,5 и 3,0 мг азота.
Установив, что эндофиты используют для азотфиксации больше сахара, чем свободно живущие бактерии, мы уменьшили аэрацию путем их культивирования в широких пробирках при слое жидкости 10 см и замены минерального азота аспарагином или нуклеинатом натрия из расчета 5 мг на литр питательной среды № 22 с рН 5,8-6,6. В широкой пробирке 50 мл питательной среды заражали небольшим количеством мицелия эндофита. В начале опыта ежедневно взбалтывали пробирки для получения большого количества отрезков гиф. Затем их помещали на 30 дней в термостат при температуре 24-28° и доступе воздуха. После этого срока 5 мл среды брали для определения сахара по Бертрану, а 45 мл — для определения азота мицелии по Кьельдалю с применением перекиси водорода. Титрование проводилось с 0,01 н. растворами серной кислоты и щелочи. Было осуществлено около 500 определений содержания азота. Отмечено, что чистые культуры эндофитов зимой фиксируют немного меньше азота, чем весной и летом.