В природных объектах рибофлавин встречается как в прочносвязанном с белками, так и в свободном состоянии. В первом случае необходимо проведение ферментативного и кислотного гидролиза, после чего производится осаждение и очистка растворов от посторонних примесей и по интенсивности флуоресценции определяется количество витамина с помощью шкалы гальванометра.
Для количественного анализа витаминов в чистых культурах эндофитов мы использовали как мицелий гриба, так и его нативную жидкость. Раздельное определение рибофлавина в культурах эндофитов, выделенных из корней сильно микотрофных растений ольхи и ирисов, установило его наличие в обеих фракциях. Большее содержание его в нативной жидкости (табл. 14) указывает на способность симбионтного гриба выделять витамины во внешнюю среду и снабжать ими растение в процессе их совместной жизни.
Как и в предыдущих исследованиях биологически активных веществ эндофитов, в этом опыте было установлено, что синтез ими витаминов определяется интенсивностью микотрофности растений, из которых были выделены грибы.
После выявления нами сильной микотрофности у картофеля на высокогорном стационаре АН СССР клубни различных сортов были направлены Е. А. Буш в Институт физиологии Грузинской академии наук для определения содержания в них витаминов. Результаты этих исследовании указывают, что картофель, выращенный в горных условиях, можно использовать как витаминный продукт (табл. 15).
H. Г. Холодный (1939), присоединял витамины к группе фитогормонов, отметил их наличие в семенах и особенно в семенах злаковых растений, в которых витамины группы В находятся в зародыше и в алейроновом слое эндосперма.
Не было необходимости в проверке способности эндофитов синтезировать ферменты, поскольку жизненные процессы их, как и всех мицелярных грибов, катализируются экзо– и эндоферментами. Известно, что ферменты грибов участвуют не только в реакциях расщепления, но и реакциях синтеза (Лилли, Барнетт, 1953). Представляло интерес сравнить набор ферментов симбионтных и сапрофитных грибов, но такая большая работа выходила за пределы возможностей нашей лаборатории.
Б. А. Рубиным с сотрудниками (1945) было установлено, что при посеве сахарной свеклы в горах в районе Алма—Аты с увеличением высоты над уровнем моря от 1000 до 2500 м не только в 5 раз повышается содержание сахара в плодах, но значительно возрастает в клетках растении количество окислительных ферментов — пероксидаз и полифенолоксидаз. Эти ферменты обеспечивают устойчивость растений к патогенным агентам и кутинизацию тканей при их механических повреждениях. Для нас очевидно, что повышение защитного действия ферментов связано с увеличением микотрофности культур на больших высотах.
Когда–то считали, что сами растения не синтезируют ферментов, которые им не нужны, но после выявления участия ферментов в процессе дыхания в науке утвердилось мнение об их синтезе растениями. Об участии в этом процессе эндофитов никто не упоминает, что, по нашему мнению, усложнило правильное решение данного вопроса. Только в теории дыхания В. И. Палладина (1950) отмечается существование в растительной ткани посредников дыхания, названных им «дыхательными хромогенами», которые при окислении превращаются в пигменты. Последнее указание автора можно отнести к симбионтным грибам растений, так как пигменты синтезируют эндофиты. Сейчас при изучении чистых культур эндофитов можно внести ясность в сложный вопрос о дыхании растений.
Аминокислоты. Изучение аминокислот в богатом азотом мицелии гриба или в его нативной жидкости представляет известные трудности из–за наличия слизистых веществ, мешающих получению четкой хроматограммы. В связи с этим их изучение проводилось в 50 мл спиртовой вытяжки, очищенной от примесей стерильным углем, что соответствовало 150 мл нативной жидкости гриба, выделенного из корней женьшеня. Указанная работа проводилась в двух различных научных учреждениях: первый раз в 1968 г. С. М. Клуновой в Московском педагогическом институте, второй раз Е. Е. Колидзевой на кафедре кормления животных в Московской сельскохозяйственной академии. Использовались разные партии гормонального препарата Симбионт 1, приготовленные из одной и той же культуры симбионтного гриба. Во втором анализе было дополнительно установлено еще 3 аминокислоты: цистнн, гистидин и метионин, которые не были обнаружены в первом анализе, Всего было выявлено 15 аминокислот, синтезируемых чистыми культурами эндофитов из женьшеня (табл. 16).