Исходя из нашего опыта, сотрудничество в МГ может значительно повысить эффективность диагностики и лечения COVID-19.
II. Этиология и индикаторы воспаления
1 Обнаружение нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2
1.1 Сбор образцов
Для повышения чувствительности обнаружения важна «правильность» образцов, а также способов и сроков их сбора. Можно выделить следующие виды образцов: образцы из верхних дыхательных путей (мазки из зева, мазки из носа, носоглоточные секреты), образцы из нижних дыхательных путей (мокрота, секреты дыхательных путей, жидкость бронхоальвеолярного лаважа), кровь, кал, моча и конъюнктивальные секреты. Мокрота и другие образцы из нижних дыхательных путей имеют высокий коэффициент позитивности нуклеиновых кислот, их сбор является предпочтительным. SARS-CoV-2 разрастается преимущественно в альвеолярных клетках II типа (АТ2), а пик вирусовыделения наступает через 3–5 дней после начала болезни. Таким образом, если тест на нуклеиновую кислоту вначале отрицательный, следует продолжить сбор проб и протестировать их в последующие дни.
1.2 Обнаружение нуклеиновой кислоты
Анализ на нуклеиновые кислоты — предпочтительный метод диагностики инфекции SARS-CoV-2. Процедура тестирования согласно приведенным в наборе инструкциям выглядит следующим образом: Образцы подвергаются предварительной обработке, и вирус подвергается лизису для вычленения нуклеиновых кислот. Три специфических гена SARS-CoV-2, а именно: открытая рамка считывания 1a/b (ORF1a/b), гены нуклеокапсидного белка (N) и белка оболочки (E) — затем амплифицируются по методике количественной ПЦР в реальном времени. Амплифицированные гены обнаруживаются интенсивности флуоресценции. Назовем критерии положительных результатов анализа на нуклеиновые кислоты: Положительный тест на ген ORF1a/b и (или) ген N (ген E).
Одновременное обнаружение нуклеиновых кислот в нескольких видах образцов может повысить точность диагностирования. Примерно у 30–40 % пациентов с подтвержденным положительным анализом на нуклеиновую кислоту в дыхательных путях обнаружена вирусная нуклеиновая кислота в крови, а примерно у 50–60 % пациентов с подтвержденным положительным анализом на нуклеиновую кислоту в дыхательных путях обнаружена вирусная нуклеиновая кислота в кале. Однако коэффициент позитивности тестирования на нуклеиновые кислоты в образцах мочи не очень высок. Комплексное тестирование образцов из дыхательных путей, кала, крови и других видов образцов помогает повысить диагностическую чувствительность в случае подозрения на болезнь, улучшить контроль за эффективностью лечения и руководство изоляционными мероприятиями после выписки.
2 Выделение и культивирование вируса
Культивирование вируса должно осуществляться в лаборатории с подтвержденным 3-м уровнем биологической безопасности (BSL-3). Вкратце процедуру можно описать следующим образом: У пациента берутся свежие образцы мокроты, кала и другие пробы, после чего они инокулируются в клетках Vero-Е6 для культивирования вируса. Цитопатический эффект (ЦЭ) наблюдается через 96 часов. Обнаружение вирусной нуклеиновой кислоты в культуральной среде свидетельствует об успешном культивировании. Определение титра вируса: После последовательного растворения вирусного посевного материала в 10 раз TCID50 определяется микроцитопатическим методом. В противном случае жизнеспособность вируса определяется бляшкообразующей единицей (БОЕ).
3 Обнаружение сывороточного антитела
После заражения SARS-CoV-2 образуются специфические антитела. К методам определения сывороточных антител относятся иммунохроматография с использованием коллоидного золота, твёрдофазный иммуноферментный анализ, иммунохемилюминесценция и др. Положительный результат анализа на антигенспецифичный сывороточный титр класса IgM — или если титр специфических антител класса IgG в фазе выздоровления в >4 раза выше по сравнению с острой фазой — можно использовать в качестве диагностических критериев у пациентов с подозрением на COVID-19 и отрицательным результатом обнаружения нуклеиновых кислот. Во время диспансерного наблюдения IgM обнаруживается через 10 дней после появления симптомов, IgG — через 12. Вирусная нагрузка постепенно уменьшается по мере увеличения уровня сывороточных антител.
4 Выявление индикаторов воспалительной реакции
Рекомендуется сдавать анализы на С-реактивный белок, прокальцитонин, ферритин, D-димер, общее содержание и субпопуляции лимфоцитов, интерлейкине IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a, INF-y и другие индикаторы воспаления и иммунного статуса, которые могут помочь оценить клиническое течение болезни, оповещать о тяжелых и критических состояниях, а также служить основой для формирования стратегий лечения.