Известие, что королева вышла замуж за убийцу своего прежнего мужа, послужило причиной того, что почти все поверили в ее причастность к убийству Дарили. Это мобилизовало ее противников, которые заключили союз с целью свергнуть королеву с трона. Противоборствующие стороны встретились 15 июня 1567 года под Карберри-хилл. Сражение завершилось отступлением части отрядов Марии, ее капитуляцией и бегством Ботвелла. Захваченную в плен королеву привезли в замок Лохлевен и вынудили отречься O I престола в пользу ее сына, которому на тот момент исполнилось тринадцать месяцев. От имени ребенка начал править его регент, граф Морей.
Королева не потеряла надежды вернуть трон. В начале мая 1568 года она смогла бежать и присоединиться к армии своих сторонников под предводительством графа Аргайла, которую, однако, разгромило войско конфедератов в сражении при Лангсайде. Мария была вынуждена искать укрытие за пределами Шотландии. Ее выбор пал на Англию — вероятно, она рассчитывала, что Елизавета Тюдор по-родственному предоставит ей убежище и поддержит в попытках вернуть себе шотландскую корону.
Королева Англии приняла Марию, но не как гостью, а как узницу. На протяжении последующих 18 лет, несмотря на корректное обращение и достойные условия жизни, ее свободу медленно, но верно ограничивали. Королеву переводили из одной резиденции в другую, за ней следили, в ее окружении были шпионы, а корреспонденция подвергалась просмотру.
Несмотря на это, Мария не оставила надежду вернуть себе корону, тем более что она могла рассчитывать на помощь таких влиятельных лиц, как король Испании Филипп II. В самой Англии также хватало ее сторонников, считавших, что королева Шотландии должна занять английский престол. Среди них было много аристократов, прежде всего представителей рода Говардов, Перси и Невиллов, которым была не по вкусу сильная позиция Уильяма Сесила, главного советника королевы Елизаветы, при дворе. В 1569 году, воспользовавшись помощью испанцев, они организовали заговор, целью которого было освобождение Марии, провозглашение ее королевой (или по крайней мере ее повторное воцарение в Шотландии) и возвращение Англии в лоно католической церкви. Однако восстание закончилось поражением, вызвав ужесточение политики по отношению к католикам и более строгий контроль за действиями королевы-пленницы.
Заговор Ридольфи, как его называли, окончательно убедил Елизавету и ее советников в том, что Мария не должна выйти на свободу, так как в этом случае она могла представлять реальную угрозу. С другой стороны, Елизавета не столько не могла, сколько не хотела приложить руку к ее физическому уничтожению, так как это означало бы поднять руку на другого монарха — помазанника Божия.
Переломным моментом стал 1586 год, когда был раскрыт очередной заговор против английской королевы. Проведенное следствие выявило, что молодой дворянин Антони Бабингтон планировал убить Елизавету, освободить Марию и посадить ее на трон. Как следовало из перехваченных английскими властями писем, Мария знала о планах заговорщиков и была с ними согласна. Трудно установить, так ли было в действительности, — некоторые историки считают, что это была английская провокация, которой тем не менее оказалось достаточно, чтобы обвинить Марию в государственной измене. Процесс, который вел лорд-канцлер, завершился признанием ее виновной и вынесением смертного приговора. Елизавета медлила, но в конце концов поставила под ним свою подпись. Приговор был приведен в исполнение 8 февраля 1587 года в замке Фотерингей. Мария Стюарт была обезглавлена и похоронена в соборе Питерборо.
На эшафоте Мария проявила удивительное самообладание. Из описания следует, что она взошла на место казни, не побледнев и не показывая признаков страха. Более того, она утешала свою плачущую прислугу. Когда палач и стражники хотели помочь ей снять верхнее одеяние, она произнесла: «Господа, я не привыкла снимать одежду в присутствии такого большого количества людей».
Казнь Марии потрясла всю Европу, а особенно католические страны, где королеву Шотландии признали мученицей. Ее смерть испортила и без того напряженные англо-испанские отношения и стала для Филиппа И стимулом к началу военных действий против Елизаветы и ее подданных. В то же время единственный сын Марии, король Шотландии Яков VI, демонстрировал удивительное равнодушие к казни матери. Очевидно, он не хотел ссориться с английской королевой, рассчитывая на то, что в этом случае она официально объявит его своим наследником. Можно предположить, что впоследствии Яков страдал от мук совести, вспоминая свое поведение в этот трагический момент: когда он в конце концов воцарился на английском троне, то принял решение о переносе тела матери в Лондон. В 1612 году состоялись вторые похороны Марии — на этот раз ее останки были погребены в Вестминстерском аббатстве, в великолепном мраморном саркофаге, который отделяет лишь несколько метров от места последнего упокоения Елизаветы I.