Противостояние сразу нескольких противоборствующих сил до предела осложнило обстановку в Леванте. Особенно это почувствовалось после захвата Багдада войсками Тимура в 1392 году. В 1403 году госпитальеры, никогда не колебавшиеся перед заключением временных союзов со своими вчерашними врагами против нового могущественного противника, договариваются о совместных действиях с египетскими мамлюками. Согласно условиям соглашения, орден получал право открыть свои представительства в Дамиетте и Рамле и восстановить свой старый госпиталь в Иерусалиме. Эта договоренность с мамлюками принесла ордену почти четыре десятилетия мирной передышки. Тем не менее работы по возведению новых фортификационных сооружений на Родосе продолжались, а галеры регулярно выходили в море из порта Мандраччио.
К середине XV века военно-политическая ситуация меняется, и соотношение сил в Восточном Средиземноморье становится не в пользу госпитальеров. Взятие Константинополя в 1453 году победоносными войсками султана Мехмета II прозвучало для ордена сигналом смертельной опасности. Мехмет II был искусным полководцем, образованным человеком, знал несколько языков, и завоевание Родоса было для него лишь вопросом времени. Над госпитальерами нависла смертельная угроза.
И вот к крепости госпитальеров подошло семидесятитысячное войско султана. Великим магистром ордена был тогда Пьер д’Обюссон. Мощи турецкой армии он мог противопоставить только 600 рыцарей, включая оруженосцев, и от 1,5 до 2 тыс. человек наемных иностранных войск. На стороне рыцарей сражалось и местное население, которому раздали оружие. Количество рабов, также участвовавших в военных действиях, в те времена никто не учитывал.
Безусловно, силы никак нельзя назвать равными. В конце концов огромное численное превосходство турок и мощь их артиллерии начали сказываться на ходе осады. Южные стены города, окружавшие так называемый еврейский квартал, были практически разрушены. Защитники Родоса оказались на грани поражения. Когда 27 июля башибузуки — передовой отряд турецкого войска — пошли в атаку, казалось, что ничто уже не может спасти осажденных. Немногочисленные оставшиеся в строю рыцари отчаянно сражались в проемах полуразрушенных стен. Д’Обюссон лично возглавил оборонявшихся на самом опасном направлении. В жестокой схватке он был четырежды ранен, но продолжал сражаться, пока не упал, пронзенный копьем янычара.
И все-таки победило мужество госпитальеров. Башибузуки, увидев столь отчаянное сопротивление, в панике откатились назад, сминая подходившее подкрепление. Началась невообразимая свалка, в которой турки потеряли не менее 5 тыс. человек. Опасаясь полного разгрома, главнокомандующий турецкими войсками Мисак-паша был вынужден дать сигнал к отступлению. На следующее утро турки погрузились на ожидавшие их суда и отбыли восвояси. По дороге Мисак-паша умер от дизентерии.
И не мужество ли вкупе с искусством орденских хирургов спасло великого магистра? Он выжил. Когда весть о победе ордена достигла королевских домов Европы, на Родос хлынул поток финансовой и военной помощи. Пьер д’Обюссон немедленно развернул широкие работы по восстановлению разрушенных фортификаций Родоса. Он понимал, что рано или поздно ордену предстоит сойтись в решающей схватке с турками.
Смерть Мехмета II привела к власти его сына Баязида, который намеревался осуществить множество походов на различных направлениях против Европы, но из-за его ленивого и бездеятельного характера успеха в войне с Европой не последовало.
Гораздо серьезнее был настроен сын Баязида Селим. Воцарившись и поколебав могущество мамлюков, Селим овладел Палестиной, на стенах Иерусалима было водружено знамя с полумесяцем. Победитель Персии, властелин Египта, Селим готовился направить все свои силы против христиан. Когда в Европе стало известно, что Иерусалим оказался во власти турок, духовенство и рыцари восприняли это как иго неверных, под которое попала Святая земля, так что для возрождения духа старинных крестовых походов оставалось совсем немного.