Батько його, православний шляхтич Степан-Адам Мазепа, був високоосвіченою, передовою людиною для свого часу. Він брав досить дієву участь у Визвольній війні під проводом Б. Хмельницького, з яким був близько знайомий. Щоправда, за духом та й за віком був ближчим до соратника і спадкоємця Богданової булави Івана Виговського, з яким у нього було міцне взаєморозуміння. У 1654 році С. Мазепа став отаманом білоцерківського козацтва, але промосковських настроїв не поділяв. Після обрання І. Виговського гетьманом Степан Мазепа за його дорученням їздив до Варшави на переговори з королем Яном II Казимиром, що закінчилися підписанням Гадяцької угоди. С. Мазепа до кінця свого життя залишався прихильником пропольської орієнтації, що переважала серед козацьких старшин Правобережжя після Б. Хмельницького. Батька не стане у 1665 році – синові Івану тоді піде 26-й рік. Саме тоді польський король настановить його чернігівським підчашим.
Дитинство Івана промайнуло на тлі козацького життя – ніким, окрім як козаком чи козацьким отаманом, маленький Іван себе й не уявляв. Він уже був підлітком, як почалася Національно-визвольна війна українського народу під проводом Богдана Хмельницького, тож Іван Мазепа з дитинства був у гущі тогочасних подій і змалку себе готував до козацького життя. Казали, що їздити верхи він навчився раніше, як ходити. Вже підлітком і за юних літ своїх добре володів рушницею, пістолем, шаблею.
Мати Івана Мазепи – Марія була родом з українського шляхетства Мокевських. Продовжувала в родині традиції українського шляхетства, яке залишалося вірним прадідівській вірі. Вона була передовою жінкою свого часу, освіченою, твердого духу, свідомою патріоткою; вирізнялася палкою прихильністю до православної віри, її запам’ятали як жінку сміливу й діяльну. Вона була членом («сестрою») Луцького православного братства. По смерті чоловіка, з яким Марія прожила в любові і злагоді, постриглася в черниці, була ігуменею Флорово-Вознесенського монастиря в Києві, знана під ім’ям ігумені Магдалини. На її кошт в цьому монастирі була побудована кам’яна церква.
Мати мала великий вплив на свого сина і все життя наставляла його, допомагаючи добрими порадами. Її не стане у 1707 році. Саме матері Іван Мазепа завдячував вихованій у ньому відданості православній церкві, яку він зберігав усе життя. Мати й послала його навчатися до Києво-Могилянської колегії, де викладали відомі на той час професори, що мали освіту, здобуту в європейських університетах.
Структура колегії складалася з восьми класів (шкіл), куди входили: аналогія, інтима, граматика, синтаксема, поезія, риторика, філософія, а пізніше й богослов’я додалося.
Курс навчання тривав сім років.
У класі риторики юний Мазепа опановував мистецтво складання промов, які виголошувалися на різних урочистостях та офіційних зустрічах, святах, весіллях тощо. Тут він вчився писати різного змісту листи і послання. На практиці знавців риторики використовували ще й під час судових розборів, коли треба було довести права тієї чи тієї сторони.
Основою гуманізму києво-могилянських професорів була актуалізація закладеної в особі гідності та виховання людини-громадянина. Риторика розвивала і моральні якості людини, і почуття прекрасного у зв’язку естетики з життям, мистецтвом, вихованням активної та діяльної людини. Навчання велося латиною, що її ритори добре знали. Мазепа вивчав і питання психології, де розглядалися такі поняття, як «воля», «свобода волі», «властивості інтелекту волі» тощо. Все це врешті-решт виховувало і формувало в учнях широкий світогляд і допомогло Мазепі потім як політичному і державному діячеві.
Коли Іван закінчив колегію і повернувся додому вже освіченою людиною, мати, привітавши свого любимчика, сказала:
– Добре, синку, дуже добре! Але це лише початок – навчанню немає меж.
І відрядила сина до Кракова, де протягом року він пройшов курс Ягеллонського університету – це був один з найпрестижніших університетів не лише Речі Посполитої, а й усієї Центрально-Східної Європи. В університеті, крім різних предметів, вивчали ще й поетику, ось чому Іван Степанович – але, звичайно, маючи й талант від Бога – умів добре віршувати. (Збереглися дані, що Мазепа ще навчався у Варшаві в єзуїтській колегії, де теж давали глибоку і всебічну освіту.)