Получив от Амвросия Изложение православной веры, император Грациан по настоянию святителя убрал из зала римского сената жертвенник богини Победы (Виктории), перед которым давались языческие клятвы. Язычники в лице своего знаменитого оратора Симмаха, римского сенатора, потребовали в 382 г. водворить статую на прежнее место. Но император Грациан внял убедительным доводам Амвросия и отказал в этом иске. В том же году он повелел отписать в казну средства, ежегодно расходовавшиеся на языческие празднества, а также секвестровал земли жрецов.
Столь сильное влияние Амвросия на императора во многом объясняется его благодатными дарованиями, в особенности, даром чудотворения. Известно, например, что в том же 382 г., находясь в Риме, св. Амвросий исцелил от паралича знатную матрону в ее доме на Трастевере: болящая исцелилась, прикоснувшись к одеждам святителя во время евхаристической молитвы.
С матерью императора Юстиной, которая разделяла заблуждения ариан, у Амвросия, однако, возник конфликт. Особенно невзлюбила Юстина Амвросия после того, как тот помешал назначить на вакантное место в город Сирмий арианского епископа, ее ставленника.
В отместку Амвросию Юстина в 38S г. распорядилась отдать арианам главную базилику Медиолана (она была построена св. Амвросием на месте языческого чтилища Эскулапа и первоначально освящена им во имя св. мучеников Хрисанфа и Дарии, а затем во имя св. мучеников Гервасия и Протасия, мощи которых были в 380 г. чудесно обретены Амвросием; — см. 132, с. 98). Святитель Амвросий решительно этому воспротивился: «Я готов отдать императору всё, что принадлежит мне и положить за него самую жизнь, но я не могу дать того, что принадлежит Богу. Храм Бога не может быть оставлен Его священником», — отвечал он.
Верные Церкви христиане во главе с Амвросием в течение трех дней выдерживали в соборе настоящую осаду, распевая псалмы. Когда воины ворвались в храм и увидели святителя, продолжавшего спокойно совершать богослужение, они упали к ногам Амвросия и объявили, что пришли сюда молиться, а не сражаться.
В январе следующего, 386 г. Юстина добилась от императора издания указа, который предоставлял арианам полную свободу религиозных собраний в храмах, а за всякое им противодействие угрожал смертной казнью. Святитель Амвросий назвал этот указ «кровавым эдиктом» и вновь отверг распоряжение передать миланскую базилику еретикам. Он отказался также выполнить приказ Юстины покинуть Милан. Чтобы предотвратить возможную расправу властей с горячо любимым епископом, народ ради его безопасности неотлучно находился с ним в базилике.
Святитель Амвросий назидал верующих своими поучениями, вместе с ними молился и воспевал молитвословия. Вот тогда–то он и устроил в храме попеременное (антифонное) пение, которое вскоре широко распространилось в Церкви и стало употребляться повсеместно.
Отстаивание независимости Церкви от государства и защита ее автономных прав перед лицом светской власти — всё это продолжало и далее оставаться важным аспектом в деятельности святителя Амвросия. Ему удалось начать и завершить в Медиолане строительство двух больших базилик — Амвросианской (о которой сказано выше) и Апостольской (ныне храм св. Назария Римлянина, память 14 октября).
Не только духовная высота, но и незаурядные административно–дипломатические способности, принципиальность, твердость и мужество помогли ему достичь значительного влияния на религиозную политику императоров. Для истории IV столетия важным документальным источником является переписка святителя Амвросия, датируемая широким интервалом 379—396 гг. Она дает чрезвычайно интересные сведения об эпохе. Особенно ценно письмо, в котором святитель налагал епитимию на императора Феодосия I (379–395 гг.).
По вине императора, отомстившего восставшим подданным за убийство своего военачальника в Фессалониках, погибло множество людей в местном цирке. Исполненный пастырского дерзновения, святитель написал императору негодующее письмо. Он не допустил императора в храм, предложив ему публично покаяться, и наложил на него епитимию. Феодосии подчинился. Восемь месяцев он не присутствовал на богослужениях в храме, пребывая вместе с кающимися, и лишь затем, после публичного покаяния (на Рождество 390 года) был принят Амвросием в церковное общение. Для святителя не было различия между царем и простолюдином. И даже освободив Феодосия от епитимий, святитель не допустил императора причащаться вместе с духовенством: когда император за богослужением в кафедральном соборе Милана хотел занять привычное место в алтаре, Амвросий велел ему выйти и заставил стоять вместе со всей паствой. До того времени кесарь в воображении подданных казался существом высшего порядка, стоявшим над любыми законами. Позиция Амвросия, далеко выходящая за пределы привычного, сильно повлияла на изменение таких представлений. По образному сравнению современного исследователя, «в воображении народа образ Амвросия обретал масштабы Иоанна Крестителя перед Иродом, пророка Нафана, обличающего Давида» (123, с. 237).