Учитывая сложность использования классических фенотипических маркеров для многолетних культур, таких как ваниль, молекулярные маркеры являются мощным инструментом изучения изменчивости культивируемой ванили, выяснения взаимосвязей между видами, определения межвидовых гибридов и выявления важных генотипов (Minoo et al., 2006a). Поэтому они очень полезны для мониторинга и оценки достижений биотехнологий.
Размножение и методы разведения
Коммерческая ваниль всегда размножается стеблевыми черенками здоровых сильно-рослых растений и может быть срезана с любой части лианы. Длина черенка обычно определяется количеством доступного посадочного материала. Коротким черенкам длиной 20 см потребуется 3–4 года, чтобы зацвести и заплодоносить. Обычно предпочтительны черенки длиной 90–100 см, так как они имеют тенденцию к более раннему цветению. Когда они активны, со свободными концами свисающими с опор, то зацветут и заплодоносят через 1-2 года. Черенки обычно сразу высаживают на место, но при необходимости их первоначально подращивают на грядках. Из-за своей сочной природы черенки при необходимости можно хранить или транспортировать до двух недель.
Традиционно гермоплазму ванили хранят в биорепозиториях, принадлежащих ботаническим садам и научным учреждениям. Высокая стоимость традиционных систем ограничивает количество хранимых образцов. Для уменьшения потерь биоразнообразия и сохранения исчезающих видов, были предприняты попытки сохранять виды ванили in vitro (Jarret and Fernandez, 1984; Minoo et al., 2006b).
В селекционных целях ваниль можно выращивать из семян. Гибридизация и выращивание растений из семян проводились в Пуэрто-Рико и на Мадагаскаре. Семена необходимо продезинфицировать, промыть в стерильной дистиллированной воде и культивировать в питательной среде Кнудсона (Knudson, 1950). Прорастание семян ванили лучше, если культуры содержатся в темном инкубаторе при 32°C. Для прорастания семян межвидовых скрещиваний V. planifolia и V. pompona требуется более высокая температура в 34°C.
Проращивание семян in vitro
Ваниль дает множество мелких семян, которые не прорастают в естественных условиях. Для успешного проращивания семян можно использовать технику культивирования тканей. Протоколы для выращивания семян и зародышей ванили стандартизированы (Gu et al., 1987; Knudson, 1950; Minoo et al., 1997; Withner, 1955).
Посев семян на различных базальных средах показал, что семена ванили не имеют строгих требований к питанию для начала прорастания, в отличие от некоторых наземных орхидей умеренного климата (Minoo et al., 1997). Прорастание семян начинается в течение четырех недель после культивирования, и начальные стадии прорастания типичны для большинства орхидей, такие как набухание зародыша с последующим разрывом семенной оболочки и последующее появление протокорма (рис. 5.3). Семена прорастали непосредственно в проростки в среде, дополненной одним бензиладенином (БА) (0,5 мг/л), без какой-либо промежуточной фазы каллуса, и, таким образом, их можно было использовать для получения самоопыленных потомков/проростков. Добавление триптона имело стимулирующий рост эффект на размер и развитие протокорма, независимо от базовой среды, в которую он был добавлен. При обработке БА большинство протокормов оставались такими же, с чешуевидными примордиальными листьями и развивающимися в побеги, тогда как обработка добавками ауксина показала постепенную дезорганизацию протокорма в каллус. Среда Мурасиге и Скуга (МС), для культур ванили in vitro, давала лучший отклик, чем среда Кнудсона. Минимальная всхожесть (26%) наблюдалась в среде МС при половинной концентрации, а максимальная (85%) была зарегистрирована в среде МС полной концентрации с добавлением 2 г/л триптона (Minoo, 2002).
РИСУНОК 5.3. Прорастание семян in vitro.
Считается, что потребность в цитокинине для прорастания связана с использованием липидов, которые составляют основной запасной материал в большинстве семян орхидей, и было замечено, что, если запасной липид не используется, прорастание не продолжается (De Pauw et al., 1995).
Известно, что ваниль, культура с перекрестным опылением, имеет множество мейотических и постмейотических хромосомных аномалий (Ravindran, 1979). В результате можно получить различные цитотипы в семенном потомстве. Таким образом, выращивание из семян может дать множество генетически разнообразных типов. Исследования прорастания семян ванили и полученного в результате потомства in vitro показали морфологические и биохимические вариации. На самоплодных потомках V. planifolia были изучены профили изоферментов супероксиддисмутазы (SOD) и пероксидазы (PRX). Профили четко указывают на различия между потомками, выраженные наличием или отсутствием конкретных полос. Максимальное сходство, которое продемонстрировали эти потомки, составило 47,37%, что указывает на высокую сегрегацию и уровень гетерозиготности, существующие у V. planifolia (Minoo et al., 1997). Эта гетерозиготность была дополнительно подтверждена анализом AFLP (Bory et al., 2008c). Поэтому, культуру in vitro можно использовать для проращивания семян и отбора полезных генотипов из сегрегированных потомков, которые можно было бы массово размножать для получения свободного от болезней посадочного материала.