РИСУНОК 5.6. Укоренение in vitro в культурах V. planifolia.
Регенерация растений через каллусные культуры
Непрерывное вегетативное размножение и отсутствие достаточных изменений в генофонде препятствуют программам улучшения сельскохозяйственных культур. Введение сомаклональной изменчивости через каллусные культуры было предпринято для расширения узкой генетической базы. Система индукции каллуса и регенерации растений in vitro оптимизирована как для вегетативных, так и для репродуктивных тканей. Наилучшие результаты были получены при использовании вегетативных тканей, и более 80% каллусий было достигнуто в среде МС с добавлением 1 мг/л БА и 0,5 мг/л НУК. Каллус дифференцировался в побеги, которые можно было успешно размножить в соотношении 1:12 в комбинации 1 мг/л БА и 0,5 мг/л ИМК при добавлении среды МС (таблица 5.3). Укоренение in vitro индуцировали с эффективностью 100% в базальной среде МС, лишенной каких-либо регуляторов роста. Эта способность дедифференцированной ткани к регенерации является важной предпосылкой для экспериментов по генетической трансформации. Протокол был успешно распространен на находящиеся под угрозой исчезновения дикорастущий вид V. aphylla, предлагая возможность применения протокола для массового размножения, а также индукции вариаций у видов Vanilla за ограниченное время.
| Регуляторы роста (мг/л) | Образование каллуса (%) | Регенерация побегов (%) | Кол-во побегов на культуру |
|---|---|---|---|
| 0 | 0 | 0 | 0 |
| НУК (0.5) | 80 | 0 | 0 |
| БА (1.0) | 0 | — | — |
| БА (1.0) + НУК (0.5) | 80 | 90 | 10 |
| БА (0.5) + НУК (1.0) | 0 | — | — |
| БА (1.0) + ИМК (0.5) | 10 | 60 | 6 |
БА = бензиладенин, ИМК = индол-3-масляная кислота, Кин = кинетин, НУК = α-нафталинуксусная кислота.
Сообщений об изменчивости каллус-регенерированных растений ванили немного. Они касаются успешной регенерации растений из каллусов, полученных из листьев и семян (Davidonis and Knorr, 1991; Davidonis et al., 1996; Janarthanam and Seshadri, 2008; Xju et al., 1987), и исследований среди местных коллекций ванили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) (Rao et al., 1993a). Исследование, включающее случайным образом отобранные каллус-регенерированные потомства, показало изменчивость морфологии и профилей RAPD (рис. 5.7) среди регенерированных из каллусов растений, по сравнению с контрольным растением V. planifolia (Minoo, 2002). Показано, что с помощью этого протокола может быть получена значительная вариабельность, которая может быть использована в программах улучшения ванили для создания вариантов с желаемыми агрономическими характеристиками.
РИСУНОК 5.7. Профили RAPD потомков ванили, регенерированных из каллуса, с использованием праймера OPERON OPA10. 1 – лестница 1 kb, 2–23: растения, регенерированные из каллусов, 24 – контроль (V. planifolia).
Культуры каллуса из листовых эксплантатов V. planifolia показали лучшее инициирование каллуса, чем культуры из узловых эксплантатов с максимальной продукцией биомассы каллуса при культивировании на базальной среде МС, содержащей 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и БА. Каллус, перенесенный в базальную среду МС с добавлением 3 мг/л БА и 2,5 мг/л μМ НУК, показал лучший ростовой ответ. Производство каллуса V. planifolia, экстракция ванилина и использование феруловой кислоты для увеличения содержания ванилина запатентовано (Davidonis et al. 1996).
Сообщалось о наследственных сомаклональных вариациях в отношении различных признаков устойчивости, а именно: устойчивости к метионинсульфоксиму (Carlson, 1973) и Pseudomonas syringae (Thanutong et al., 1983) у табака, устойчивости к Fusarium oxysporum у томатов (Evans et al., 1984), а также устойчивости к Helminthosporium sativum (Chawla, Wenzel, 1987) у пшеницы. В будущих попытках генетически трансформировать ваниль, способность трансформированной ткани к регенерации является решающим условием. Оптимизированный протокол регенерации (Minoo, 2002) может сократить продолжительность экспериментов по генетической трансформации, вызывая высокую частоту регенерации.