Процедура хранения гермоплазмы ванили путем криоконсервации кончиков побегов с использованием метода инкапсуляции/дегидратации была стандартизирована (рис. 5.11). Кончики побегов, выращенных in vitro, инкапсулировали в 4% альгинате натрия. Инкапсулированные шарики подвергали предварительной обработке путем постепенного увеличения концентрации сахарозы от 0,1 до 1,0 М с последующей дегидратацией в течение 8 часов до содержания влаги 22%. Затем последовало быстрое замораживание путем погружения в жидкий азот. Криоконсервированные кончики побегов размораживали через 12 часов, выдерживая их на водяной бане при 40°C в течение 3 минут. Оттаявшим пропагулам давали возможность восстановиться на МС с 3% сахарозой, 1 мг/л БА и 0,5 мг/л ИМК в темноте в течение одной недели, а затем переносили на свет для повторного роста и размножения. Семьдесят процентов пропагул были восстановлены, выращены и размножены в полноценные растения (Ravindran et al., 2004).
РИСУНОК 5.11. Прорастание криоконсервированных побегов.
После полного внедрения, криоконсервация обеспечит быстрое и дешевое средство для дублирования базовой коллекции из соображений безопасности, а также для распространения наборов гермоплазмы в другие страны/континенты.
Производство синтетических семян
Технология синтетических семян была стандартизирована путем инкапсуляции на 3–5 мм регенерированных in vitro почек побегов и протокормов в 4%-ном альгинате натрия для получения жестких шариков хорошего качества, идеально подходящих для выдерживания низких температур и криоконсервации. Более высокие концентрации альгината не подходили, поскольку они давали очень твердую матрицу, которая препятствовала появлению почек побегов и тем самым влияла на скорость прорастания и восстановления, тогда как при более низких концентрациях альгината с гранулами было трудно обращаться во время криоконсервации и извлечения. Синтетические семена хранили при 5°C, 15°C и 22°C для изучения влияния температуры на их хранение и жизнеспособность. Низкие температуры (5°C и 15°C) не подходят для синтетических семян. Побеговые почки размером 0,4–0,5 см подходили для инкапсуляции, поскольку более мелкие почки не выдерживали хранения и теряли жизнеспособность в течение месяца. Однако, при температуре 22±2°C синтетические семена можно хранить в течение 10 месяцев (рис. 5.12). Растения, полученные из этих инкапсулированных почек, были явно здоровыми и превратились в нормальные растения.
РИСУНОК 5.12. Синтетические семена.
Клональное размножение V. planifolia с использованием инкапсулированных почек побегов было описано George et al. (1995). Синтетические семена идеальны для сохранения и обмена гермоплазмы, особенно у ванили, где нет естественного набора семян.
Выделение и слияние протопластов
Методы выделения и слияния протопластов важны из-за далеко идущих последствий в исследованиях улучшения растений путем модификации клеток и соматической гибридизации. была изучена Возможность протопластных систем у пряных культур, таких как кардамон, имбирь и ваниль (Triggs et al, 1995; Geetha et al., 2000).
Протопласты были успешно выделены из V. planifolia и V. andamanica при инкубации в растворе фермента, содержащем мацерозим R10 (0,5%) и онозука целлюлазу R10 (2%), в течение 8 часов при 30°C в темноте (таблица 5.4). Перед ферментативным раскрытием, листья in vitro подвергали плазмолизу в растворе, содержащем промывочные соли протопластов клеток с 9% маннитом. Поскольку у ванили было трудно отшелушивать нижний эпидермис, плазмолизированную ткань листа механически мацерировали, соскребая нижнюю поверхность листа острым лезвием и инкубируя с различными концентрациями и комбинациями растворов ферментов. Периодические микроскопические наблюдения показали высвобождение кластеров клеток и отдельных клеток после 2 ч инкубации в растворе фермента.
| Вид | Раствор ферментов | Условия инкубации | Выход протопластов | Жизнеспособность (%) |
|---|---|---|---|---|
| V. planifolia | 0.5% мацерозим R10 + 2% целлюлаза онозука R10 | 8 часов при 30°C в темноте | 2.5 × 105/г листа | 72 |
| V. andamanica | 1% мацерозим R10 + 3% гемицеллюлаза + 6% целлюлаза онозука R10 | 8 часов при 30°C в темноте | 1 × 105/г листа | 55 |