После длительной борьбы с администрацией Военно-медицинской академии (отношения с которой стали натянутыми после его реакции на увольнение Циона) Павлов в 1883 г. защитил диссертацию на соискание степени доктора медицины, посвященную описанию нервов, контролирующих функции сердца. Он был назначен приват-доцентом в академию, но вынужден был отказаться от этого назначения в связи с дополнительной работой в Лейпциге с Гейденгайном и Карлом Людвигом, двумя наиболее выдающимися физиологами того времени. Через два года Павлов вернулся в Россию.
Многие исследования Павлова в 1880-х годах касались системы кровообращения. Наибольшего расцвета творчество Павлова достигло к 1879 г., когда он вплотную занялся исследованиями физиологии пищеварения, которые продолжались свыше 20 лет. В своей книге «Лекции о работе главных пищеварительных желез» Павлов рассказал о своих опытах и наблюдениях, о приемах работы. За этот труд он и получил в 1904 г. Нобелевскую премию.
Будучи от рождения левшой, как и его отец, Павлов постоянно тренировал правую руку и в результате настолько хорошо владел обеими руками, что, по воспоминаниям коллег, ассистировать ему во время операций было очень трудной задачей: никогда не было известно, какой рукой он будет действовать в следующий момент.
Преданность Павлова экспериментальной науке была всецелой. Его совершенно не интересовали бытовые условия жизни. В 1881 г. он женился, и его жене, Серафиме Васильевне, пришлось полностью взять на себя решение всех текущих проблем. Таково было взаимное соглашение, заключенное в самом начале супружества. Со своей стороны Павлов обязался никогда не пить, не играть в карты и ходить в гости или принимать гостей только в выходные дни. Его бескорыстная одержимость работой доходила до такой степени, что жене иной раз приходилось напоминать ему о получении жалования. Впрочем, жалование ученых в нашем отечестве никогда не было высоким. Долгие годы семья Павловых жила крайне стесненно. В 1884 году, когда Павлов работал над докторской диссертацией, родился первый ребенок. Хрупкий и болезненный младенец не сможет выжить, говорили врачи, если мать и ребенок не смогут отдохнуть за городом, в благоприятных условиях. Деньги на поездку пришлось занимать, однако было уже поздно: ребенок умер. Некоторое время Павлов вынужден был ночевать на койке в своей лаборатории, а жена и второй ребенок жили у родственников, ибо собственное жилье было не по карману. Группа студентов Павлова, зная о его финансовых затруднениях, передала ему деньги под предлогом покрытия расходов на демонстрации опытов. Из этой суммы ученый не взял себе ни копейки, все потратил на своих лабораторных собак.
На протяжении всей своей научной деятельности Павлов сохранял интерес к влиянию нервной системы на функционирование внутренних органов. В начале ХХ в. его эксперименты, касающиеся пищеварительной системы, привели к изучению условных рефлексов. Открытие условных рефлексов, как и многие другие выдающиеся научные достижения, произошло, по мнению многих ученых, совершенно случайно, когда Павлов, исследуя работу пищеварительных желез, – для того, чтобы получить возможность собирать желудочный сок вне организма собаки, – воспользовался методом хирургического вмешательства. Павлов и его коллеги обнаружили, что если пища попадает в рот собаки, то начинает рефлекторно вырабатываться слюна. Когда собака просто видит пищу, то также автоматически начинается слюноотделение, но в этом случае рефлекс значительно менее постоянен и зависит от дополнительных факторов, таких, как голод или переедание. Суммируя различия между рефлексами, Павлов заметил, что «новый рефлекс постоянно изменяется и поэтому является условным». Таким образом, один только вид и запах пищи действует как сигнал для образования слюны. «Любое явление во внешнем мире может быть превращено во временный сигнал объекта, стимулирующего слюнные железы, – писал Павлов, – если стимуляция этим объектом слизистой оболочки ротовой полости будет связана повторно… с воздействием определенного внешнего явления на другие чувствительные поверхности тела».