В монастыре был крещен Иван Грозный. В его царствование было начато возведение собора Успения Пресвятой Богородицы. По архитектуре храм напоминает Успенский собор московского Кремля, несколько превосходя его по размерам. В 1606 году под западной папертью собора было погребено тело Бориса Годунова, изъятое по велению Лжедмитрия II из царской усыпальницы в Кремле и первоначально захороненное в Варсонофьевском монастыре. Здесь же похоронены его жена и дочь. Позднее паперть была разобрана, а над могилами Годуновых построена усыпальница. Роспись храма была завершена в 1684 году и в большей части сохранилась до наших дней.
Монастырь превращался в первоклассную крепость. Практически неприступная по тем временам она выдержала шестнадцатимесячную осаду польских войск в Смутное время. Не имеющая прецедентов по мужеству оборона Троицкого монастыря ознаменовалась чудесными явлениями преподобного Сергия Радонежского и других угодников Божиих, укреплявших дух героических защитников православной твердыни. Монастырь стал одним из оплотов ополчения Минина и Пожарского.
Храм Духовский (или храм Сошествия Святого Духа на Апостолов) воздвигнут в 1476 году. Сложен он из кирпича и представляет собой классический пример псковского зодчества. Завершается он невысокой синекупольной колокольней.
Венчает архитектурный ансамбль монастыря пятиярусная колокольня, построенная в 1741–1770 годы. Высота ее составляет 87 м (колокольня Новодевичьего монастыря имеет высоту 72 м, Иван Великий в Кремле – 81 м).
Ряд интересных сооружений создан на территории лавры в XVIII в.: небольшая Михеевская церковь рядом с трапезной, выросшая в 1734 году над местом погребения Михея Радонежского; восьмигранная барочная Смоленская церковь (церковь Одигитрии), построенная, вероятно, архитектором Ухтомским в 1746–1748 годах на средства графа А. Г. Разумовского (предание связывало ее постройку с тайным браком императрицы Елизаветы Петровны с последним), обладает четырьмя широкими каменными лестницами, расположенными по периметру, и каменными балюстрадами. Поставленный после возобновления лавры иконостас в Смоленской церкви – из уничтоженной московской церкви Параскевы Пятницы, что на Пятницкой улице.
Прославленная обитель Живоначальной Троицы на протяжении столетий является одной из самых почитаемых общерусских святынь, крупнейшим центром духовного просвещения и культуры. В ее стенах подвизался сонм подвижников Русской православной церкви, и в их числе преподобные Никон Радонежский, Максим Грек, духовные писатели преподобные Епифаний Премудрый и Пахомий Логофет. Священноархимандритами лавры были святители Московские Филарет (Дроздов, умер в 1867 году) и Иннокентий (Вениаминов, умер в 1879 году), а также священномученик митрополит Владимир (Богоявленский, умер в 1918 году). В лавре веками собиралась уникальная библиотека рукописных и старопечатных книг. Постриженниками лавры основаны и духовно обустроены сотни русских монастырей.
В 1744 году монастырь получил почетное наименование лавры. Славный период в истории лавры связан с именем митрополита Московского Платона (Левшина; умер в 1812 году). В XVIII–XIX вв. в окрестностях лавры возникли Вифанский монастырь, Боголюбский, Черниговско-Гефсиманский скиты и скит Параклита. Эти небольшие обители, духовно и административно связанные с лаврой, явили миру замечательных старцев-подвижников.
С 1814 года на территории Троице-Сергиевой лавры располагается Московская Духовная академия – старейшее высшее учебное заведение России, основанное в 1685 году в Москве. Переведенная после пожара 1812 года в лавру, академия разместилась в бывших Царских чертогах (XVII в.).
Троице-Сергиева лавра являлась одним из богатейших монастырей России, входила в число самых крупных землевладельцев (в 1763 году, в преддверии крупной конфискации церковных земель, лавре принадлежало более 100 тысяч душ крестьян). Активная торговля (зерновыми, солью, предметами быта) способствовала преумножению богатств монастыря; его финансовое положение в XVII–XVIII вв. отличалось большой прочностью; велики были пожертвования в пользу русской армии (в 1812 году – около 70 тысяч рублей), ополчения. К началу XX века в ведении лавры находились типография (в ней печатались произведения философов, священнослужителей – П. А. Флоренского, Климента Охридского и других), две гостиницы (на территории Посада), мастерские (производство игрушек, подсвечников, крестов и т. п., резьба по дереву), лавки, конные дворы. В 1910-е годы в лавре жило более 400 монахов.
В 1920 году Троице-Сергиева лавра была закрыта. В ее зданиях с разместились историко-художественный музей, другие учреждения. Часть строений заняли под жилье.