Непросто складывались отношения и с самой императрицей. Н.А. Соколов пишет: «Случилось самое опасное: Императрица не подчинилась авторитету науки и в своей болезненной самоуверенности вздумала подчинить авторитет науки своей больной воле. Я отдаю должное доктору Евгению Сергеевичу Боткину. Джентльменски благородный, он доказал свою глубокую преданность царской семье своей смертью. Но я не могу не признать, что он не обладал ни достаточной волей, ни достаточным авторитетом, чтобы взять в свои руки больного человека. Не врач победил его, а наоборот: этот больной человек победил врача. Сама судьба не благоприятствовала Государыне. Отдав всего себя царской семье, Боткин нажил драму в своей личной семье и оказался одинок. Страдая, он нашёл себе облегчение в личности Императрицы, пробудившей в нём религиозное настроение. В конце концов вынужден был признать правду и Боткин. В период царскосельского заключения он вышел однажды из комнаты Императрицы в сильно подавленном состоянии и пришёл в комнату Жильяра. Тот спросил его, что с ним. Боткин не отвечал, задумался, а затем сказал вслух: „Теперь я как врач не могу считать Её Величество вполне нормальной“».
Внешне для Е.С. Боткина всё складывалось вполне благополучно. В Царском Селе ему был предоставлен большой казённый дом (в нём он с началом Первой мировой войны открыл лазарет для раненых солдат), он получил чин действительного статского советника (генерал-майора), как лейб-медик, носил генеральское пальто и погоны с вензелями императора, ему подавался выезд: карета, запряжённая парой лошадей в блестящей орлами упряжи, с кучером, тоже увенчанным орлами, в треуголке. (Кстати, когда в Тобольске солдаты, охранявшие семью царя, потребовали от Боткина снять погоны, он отказался сделать это, предпочтя заменить форменную одежду гражданским платьем.)
Но семейная жизнь Е.С. Боткина складывалась трагически: в младенчестве умер первенец; другой сын, Дмитрий, хорунжий лейб-гвардии казачьего полка, был убит в самом начале Первой мировой войны; с молодым студентом ушла жена Боткина, бросив его с тремя детьми.
Единственную отраду в жизни доктор находил в служении царской семье. Он настолько проникся чувством преданности императорской чете, что писал в одном из писем: «Своей добротой Они сделали меня рабом своим до конца дней моих».
Говоря, что любит Их Высочеств не меньше, чем своих детей, Е.С. Боткин доказывал это на деле. Когда весной 1917 г. его дочь Татьяна была больна ревматизмом и лежала в постели, он почти не бывал дома, проводя дни и ночи у больных детей царя, заразившихся корью от маленького кадета, приезжавшего из Петрограда в гости к цесаревичу. Покидая Тобольск в апреле 1918 г. вместе с членами царской семьи, он оставлял в полной неизвестности своих детей — Татьяну и Глеба, которых он, кстати говоря, так никогда больше и не увидел, и на вопрос императрицы «А как же ваши дети?» отвечал, что на первом месте для него всегда стоят интересы Их Величеств.
Когда после отречения Николая II от престола он и его семья были арестованы и заключены под домашний арест в Александровском дворце Царского Села, а многочисленная челядь разбежалась, то из всего штата придворных врачей остались только двое: Е.С. Боткин и В.Н. Деревенко.
Можно сказать, что Боткин не мыслил себе жизни без царской семьи. На вопрос императрицы, «согласен ли он, в случае отъезда Их Величеств за границу, ехать тоже, он ответил утвердительно».
Находясь вместе с членами царской семьи под арестом, Боткин был временно выпущен из дворца в связи с тяжёлой болезнью его невестки. Когда опасность для жизни молодой женщины миновала, он, предварительно справившись, желают ли Их Величества его возвращения, и получив утвердительный ответ, обратился с просьбой к коменданту дворца полковнику Кобылинскому получить разрешение на это от Керенского. Известно, что Керенский лично принимал Е.С. Боткина в Петрограде в конце июля 1917 г. Доктор вернулся во дворец 30 июля, а в ночь на 1 августа всю царскую семью и их ближайшее окружение отправили в Тобольск.
Совместное пребывание в столь необычных — экстремальных, сказали бы мы теперь — условиях ещё более сблизило Е.С. Боткина с членами царской семьи. Доктор занимался с наследником русским чтением. Как пишет Т. Мельник, «они оба увлекались лирикой Лермонтова, которого Алексей Николаевич учил наизусть, кроме того, он писал переложения по картинам, и мой отец наслаждался этими занятиями». Великим княжнам Боткин преподавал биологию.